Флоренс Найтингейл родилась 12 мая 1820 года во Флоренции, Италия, а выросла в Англии, в Дербишире и Лондоне. Ее семья была вполне обеспечена, и девочка получила классическое домашнее образование. Родители придерживались консервативных взглядов, старались передать дочери свои представления о надлежащей роли женщины в обществе — роли, которую Найтингейл не принимала с самого начала и считала ее крайне ограниченной. 17 февраля 1837 года, накануне своего первого выхода в свет, в Лондоне Найтингейл услышала глас Божий, повелевший ей посвятить свою жизнь служению. Какое именно служение Бог имел в виду, поначалу не было ясно, и только по прошествии девяти лет она нашла ответ. Между тем поездка в Европу, продлившаяся полтора года, помогла расширить горизонт и выйти за рамки семейного круга, победив клаустрофобию семейной жизни. Находясь в Париже, Флоренс посещала салон Мари Кларк, где ее поразило отношение к женщине как равноправной мужчине, и как к другу, а не только как к жене или возлюбленной. По возвращении в Англию, в удушающие объятия своей семьи, Найтингейл заболевает. Ее выходила сестра отца Мэй Смит, и с тех пор они стали неразлучными подругами. Биограф Найтингейл Сесил Вудхэм-Смит характеризует их взаимоотношения следующим образом: «Несмотря на разницу в возрасте, Мэй обожала Флоренс, считала ее необыкновенным человеком и стала ее заступницей, толковательницей ее идей и утешительницей. По словам Найтингейл, обе они были „как двое влюбленных“».
На протяжении 40-х годов другой сильной привязанностью Найтингейл была кузина Мэриан Николсон, о которой она позже писала следующее: «В своей жизни я страстно любила только одного человека. Это была Мэриан». С другой стороны, складывалось впечатление, что Мэриан волновал только ее брат Генри, который в свою очередь влюбился в Найтингейл. Об этом периоде жизни Флоренс Вудхэм-Смит пишет так: «Флоренс была глубоко, страстно неудовлетворена жизнью и собой. Ее влюбленность в Мэриан была постоянной пыткой. Она позволила Генри увлечься собой более, чем когда-либо прежде… Жизнь в отчем доме была непереносима; не может быть, чтобы Бог одарил свое создание — женщину — временем, чтобы тратить его… „на всякую чепуху и бесконечное опрыскивание духами“».
После шести лет знакомства Генри наконец сделал Флоренс предложение, и, хотя Найтингейл подумывала о семейной жизни с ним как о возможности быть ближе к Мэриан, все же в последний момент она отказала ему. Разгневанная Мэриан усмотрела в отказе предательство по отношению к брату, который столько лет ухаживал за Найтингейл, и резко прекратила свою дружбу с Флоренс. Это был тяжелый удар, и Найтингейл всерьез подумывала о том, чтобы оставить мирскую жизнь и постричься в монахини.
Утратив надежду сделать что-нибудь полезное в своей жизни в то время, когда о профессиональной деятельности для женщины просто не было и речи, Найтингейл в 1846 году испросила у своей семьи разрешения обучаться на медсестру в больнице Солсбери. Она писала своей подруге Хилари Бонхэм Картер: «Я полагала, что можно было бы учредить, не давая обетов, что-то вроде Протестантской общины сестер для женщин с утонченными чувствами. Но на первых порах возникли затруднения, и это испугало маму. Речь не идет о физическом отвращении, которое могут вызывать некоторые моменты работы в больнице, имеется в виду происходящее между хирургами и медсестрами, о чем вы можете догадываться». Вот какими наблюдениями делится ее биограф Делл Ричардз: «В те дни работа медсестры была занятием неуважаемым. Это было последним прибежищем женщин спившихся, которые не задерживались на других работах, и женщин, подрабатывавших проституцией. Не было подготовки, не было школ. Женщины попросту просиживали у кровати больного или умирающего, если они не делили с ним эту постель или не падали на пол мертвецки пьяные». Едва ли им можно было доверить элементарные обязанности медсестры. Однако у Найтингейл была железная воля, и она начала проходить обучение тайно. За три года Флоренс стала хорошо разбираться в вопросах общественного здравоохранения и проблемах больниц. В 1850 году Найтингейл успешно сдала экзамены в Институт протестантских священников в Кайзерсверте, Германия, где прошла полный курс обучения на медсестру. В 1853 году Найтингейл получила место старшей медсестры в лондонском Институте оказания медицинской помощи больным женщинам, не имеющим средств на лечение, где ее нововведения быстро привлекли внимание общественности.