Исследовав болезни вина, ученый выявил микроорганизмы, вызывавшие их, и для уничтожения вредных «организованных ферментов» предложил прогревать вино при 50 — 75 °С. Изученные процессы оказались тесно связанными с техникой пивоварения, виноделия и фабрикацией уксуса. (Они же привели ученого и к познанию природы болезней.) Обоснование метода, позднее названного пастеризацией, ученый изложил в трех книгах:
Работая как каторжный, не зная каникул и выходных дней, химик превратил свою жизнь в один непрерывный опыт. Пастер прославился чрезвычайно оригинальными и в тоже время дешевыми (жизнь заставляла) экспериментами. Средства у Пастера были скудные, «приходилось изворачиваться, хлопотать, теребить начальство, которое раскошеливалось очень туго. „В бюджете нет рубрики, которая разрешала бы мне выдать полторы тысячи франков на ваши опыты“, — сказал однажды Пастеру министр народного просвещения. Это было сказано человеку, труды которого дали Франции миллиарды. Правда, министр не мог предвидеть этого. Миллиарды явились потом, результатом истин, — отвлеченных, теоретических истин, открытых и доказанных Пастером» (М.А. Энгельгардт).
Под влиянием взглядов Пастера преобразовалась одна из важнейших отраслей медицины. В 1865 г. английский хирург Дж. Листер, основываясь на работах Пастера, предложил антисептический метод лечения и производства хирургических операций. Благодаря антисептике и дезинфекции развилась хирургия, исчезла повальная смертность в госпиталях от заражения ран (например, в акушерских клиниках за 30 лет в 10 раз снизилась смертность от послеродовой горячки).
К медицинской тематике Пастер пришел после посещения им в начале 1860-х гг. госпиталей с заразными больными, причину заболеваний которых он усмотрел в микробах. При этом ученый составил программу своих исследований на много лет вперед — изучить эпидемии животных (прежде всего сибирскую язву), а затем перейти к человеку.
От намеченного плана Пастера отвлекла эпидемия пебрины, уничтожившая за 15 лет едва ли не всех шелковичных червей европейских и части азиатских шелководен. Множество народу разорилось, шелководство в мире оказалось на грани исчезновения.
Желая помочь шелководам, Пастер вместе с женой, дочерью и четырьмя учениками-препараторами в 1865 — 1869 гг. каждое лето занимался в червоводне в Алэ (юг Франции) поиском причин эпидемии. Быстро обнаружив болезнетворные микробы, ученый на поиск способа их уничтожения потратил пять лет.
В конце концов, Пастер победил пебрину, но после этого сам перенес в 1868 г. инсульт. Из тяжелейшего состояния, в котором ученый два месяца провел без движения, его вытащила жена. Исцелившись, Пастер на всю жизнь остался с полупарализованной левой половиной тела. В 1870 г. ученый опубликовал итоги своих исследований о пебрине двухтомнике
Доказав микробное происхождение «куриной холеры», сибирской язвы и септицемии (злокачественного отека), предложив метод аттенуации микроорганизмов — ослабления заразности микробов путем искусственных обработок в лаборатории, а также революционный метод профилактики эпидемий — вакцинацию животных и людей, Луи Пастер стал одним из основоположников микробиологии и иммунологии.
Точку в своих исследованиях Пастер поставил блестящим публичным экспериментом с предсказанным микробиологом результатом (1881). Взяв две одинаковые группы скота, одной из которой (контрольной) он сделал предохранительные прививки, ученый ввел животным обеих групп смертельные дозы яда. «Контрольные» не заболели, а все «обычные» погибли от сибирской язвы. Предсказание сбылось на 100%. Вслед за этими болезнями Пастер успешно исследовал тиф и краснуху (рожу свиней), также предложив вакцины для борьбы с ними.
Поистине легендарную славу Пастеру составила его последняя работа — над бешенством. Этой проблемой ученый занялся в 1880 г. Вакцину — анарабическую сыворотку — он испытал через пять лет на 9-летнем Йозефе Майстере, которого укусила бешеная собака. У Пастера не было лицензии врача, и умри ребенок, микробиолога отдали бы под суд, а результаты его многолетних трудов пошли бы насмарку. Но Луи рискнул, и после двухнедельного курса лечения Йозеф поправился. После этого выдающегося успеха в России, а затем и в странах Европы стали открывать пастеровские станции, где людям, укушенным животными, делали прививки от бешенства, чем спасли от гибели за 30 последующих лет 20 тысяч человек.