Однако так хорошо начавшееся десятилетие стало самым тяжелым для него и для его семьи. «Не хватало денег, чтобы купить мебель, кухонную, столовую и чайную посуду», - вспоминала его жена. Бесконечные скитания по чужим квартирам - долгое время Павловы жили вместе с братом Дмитрием в полагавшейся ему университетской квартире. Тяжелейшее несчастье - гибель первенца Мирчика, а буквально через год опять неожиданная смерть малолетнего сына, отчаяние Серафимы Васильевны, ее продолжительная болезнь. Все это выбивало из колеи, отнимало силы, столь необходимые для научных занятий.
Это был год, который жена Павлова назовет «отчаянным», - когда мужество изменило Ивану Петровичу. Но на помощь пришла жена. По ее настоянию ученый вплотную занялся научной работой. В 1883 году он защитил диссертацию на соискание степени доктора медицины, посвященную описанию нервов, контролирующих функции сердца.
Павлов был назначен приват-доцентом в академию, но вынужден был отказаться в связи с дополнительной работой в Лейпциге с Гейденгайном и К. Людвигом, двумя наиболее выдающимися физиологами того времени. Через два года Павлов вернулся в Россию.
Впоследствии он написал об этом - скупо, несколькими фразами обрисовав столь многотрудное десятилетие: «Вплоть до профессуры в 1890 году, уже женатому и имевшему сына, в денежном отношении постоянно приходилось очень туго, наконец, на 41-м году жизни я получил профессуру, получил собственную лабораторию… Таким образом, вдруг оказались и достаточные денежные средства, и широкая возможность делать в лаборатории что хочешь».
К 1890 году труды Павлова получили признание со стороны ученых всего мира. С 1891 года он заведовал физиологическим отделом Института экспериментальной медицины, организованного при его деятельном участии. Вместе с тем Иван Петрович одновременно оставался руководителем физиологических исследований в Военно-медицинской академии, в которой проработал с 1895 по 1925 год.
В своих исследованиях Павлов использовал методы механистической и холистической школ биологии и философии, которые считались несовместимыми. Как представитель механицизма Павлов считал, что комплексная система, такая как система кровообращения или пищеварения, может быть изучена путем поочередного исследования каждой из их частей. Как представитель «философии целостности» он чувствовал, что эти части следует изучать у интактного, живого и здорового животного. По этой причине он выступал против традиционных методов вивисекции, при которых живые лабораторные животные оперировались без наркоза для наблюдения за работой их отдельных органов.
Считая, что умирающее на операционном столе и испытывающее боль животное не может реагировать адекватно здоровому, Павлов воздействовал на него хирургическим путем таким образом, чтобы наблюдать за деятельностью внутренних органов, не нарушая их функций и состояния животного. Мастерство Павлова в этой трудной хирургии было непревзойденным. Более того, он настойчиво требовал соблюдения того же уровня ухода, анестезии и чистоты, что и при операциях на людях.
Используя данные методы, Павлов и его коллеги показали, что каждый отдел пищеварительной системы - слюнные и дуоденальные железы, желудок, поджелудочная железа и печень - добавляет к пище определенные вещества в их различных комбинациях, расщепляющие ее на усвояемые формы белков, жиров и углеводов. После выделения нескольких пищеварительных ферментов Павлов начал изучение их регуляции и взаимодействия.
Как пишет Э.А. Асратян: «В своих систематических и тщательных хронических экспериментах Павлов установил, что рефлекторная секреция слюны в сильной степени варьирует по количеству и даже по качеству в зависимости от природы, силы, количества и продолжительности действия натуральных раздражителей в виде пищевых или отвергаемых веществ на рецепторы ротовой полости. Попадает в рот пища или отвергаемое вещество (кислота, щелочь и т.д.), какой сорт пищи попадает в рот - мясо, хлеб, молоко или что-либо другое, в каком виде (сухом или жидком), в каком количестве - от этого зависит, какие слюнные железы и в каком темпе будут работать, какого состава и какое количество слюны будут выделять и т.д. К примеру, было показано, что сухая пища вызывает большее слюноотделение, чем влажная или жидкая, кислота вызывает слюну с большим содержанием белка, чем пищевые продукты, речной песок, засыпанный в рот, также вызывает обильное слюноотделение, а мелкие камешки, положенные в рот, не вызывая слюны, выталкиваются изо рта и т.д.