Издание «Острожской Библии» в условиях усиливавшегося польско-католического давления и неутешительного состояния православия в целом (после разорения монголами княжеств Руси и гибели под ударами крестоносцев и турок Византии) было культурно-просветительским подвигом. Образованные славяне восточного обряда получали в руки настоящие библейские тексты на понятном им языке. По своему значению этот труд сопоставим с переводом и публикацией Библии на немецком языке, которые на полвека ранее осуществил Лютер.
Экземпляры изданной Библии начали быстро расходиться по украинско-белорусским землям Речи Посполитой, попадая в пределы Московского царства, а также к находившимся под властью турок болгарам и сербам. Этим изданием широко пользовались люди духовного звания и православные аристократы. Однако особую роль «Острожская Библия» играла в демократической среде православных братств, массово возникавших в городах Украины и Белоруссии во второй половине XVI века. Наиболее многочисленным и влиятельным считалось Львовское братство, а с начала XVII века — Киевское. Именно братства стали очагами православной образованности, имели школы и даже библиотеки.
Работа Острожской типографии не ограничивалась изданием только Библии, в ней печаталась разнообразная богослужебная и учебная литература. В 1587 году в Остроге издается первый полемический, направленный на защиту православной веры от нападок со стороны католичества, труд Герасима Смотрицкого «Ключ царства небесного», а в следующем году — «Книжица» Василия Сурожского того же идейного направления.
Особая роль принадлежит князю Константину Константиновичу в борьбе с насаждением унии на украинско-белорусских землях в конце XVI — начале XVII веков.
Брестская уния 1596 года готовилась втайне от православной общественности и ее принятие «князьями церкви» было для основной массы не только прихожан, но и рядовых священников и монахов полной неожиданностью. Уния внесла раскол в украинско-белорусское общество в наиболее ответственный момент его истории.
В то же время польские власти создавали условия для окатоличивания представителей высших слоев украинского общества, предоставляя шляхте латинского обряда права, которыми была обделена шляхта православная (быть избранными на высшие правительственные должности — воевод и каштелянов, — а значит, заседать в сенате и реально быть среди первых людей Речи Посполитой, влияя на ее политику).
В ситуации всестороннего давления на последователей византийского обряда князь Константин Острожский оказался среди самых стойких православных аристократов и государственных деятелей Речи Посполитой высшего ранга, которые выступили против унии (кроме него это были князья Збаражские, Друцкие-Соколинские, Корецкие и др.; интересно, что в неправославной среде уния также не везде нашла поддержку: против нее выступили некоторые государственные деятели из числа римо-католиков и протестантов).
Особенное негодование князя Константина вызвало тайное, без обсуждения православной общественностью, заключение Брестской унии. В широко распространенном письме он провозгласил инициаторов унии «волками в овечьей шкуре», предавшими свою паству, и призывал верующих к открытому противостоянию. Послав официальный протест королю Сигизмунду III (который его проигнорировал), Константин Острожский вступил в антикатолический союз с польскими протестантами, угрожая поднять вооруженное восстание. Под его влиянием оставшаяся верной православию шляхта (часть которой уже входила в круги формировавшегося казачества) собиралась на уездные (волостные) сеймы и высказывалась против унии. Ведущие монастыри, и прежде всего Киево-Печерская лавра, которую в то время возглавлял ярый ревнитель православия Никифор Тур, решительно отвергли унию и предали проклятию ее инициаторов.
Этими решительными действиями Константину Острожскому совместно с друзьями и сподвижниками (Никифором Туром, Иваном Вишенским, острожским шляхтичем Мартином Броневским, писавшим под псевдонимом Христофор Филалет и др.) удалось во многом сорвать планы приведения в состояние унии всего украинско-белорусского православия. В 90-х годах XVI века в Украине появляется целое направление религиозно-полемической литературы, достигшее своего расцвета в следующие десятилетия.
Однако на православных землях польско-литовского государства возможности противостоять униатству и католическому давлению были не у всех одинаковыми. В ближайшей к Польше Галиции и на большей части Волыни позиции католицизма к концу XVI века были уже весьма сильны и власть принадлежала католикам, в том числе из знатных западно-украинских родов. Но Среднее Поднепровье было затронуто польско-католическим влиянием еще относительно мало. Более того, пост киевского воеводы сохранял за собой приверженец православия Константин Острожский.