В Киеве Д. Туптало читал лекции по философии и другим дисциплинам в родном для него Киево-Могилянском коллегиуме. Его курсы в целом соответствовали преподававшимся в ведущих европейских университетах. В них преобладал дух позднего аристотелизма в свойственной православной традиции теологически-платонической интерпретации. Их отличало свободное обсуждение вопросов религиозной философии.
Из-под пера Д. Туптало вышло множество разнообразных стихотворных и прозаических литературных произведений, отмеченных возвышенным стилем. Как и в католических странах тогдашней Европы, в Киеве чрезвычайно популярными были «эмблематические вирши» — стихотворные надписи символического содержания к гравированным эмблемам и гербам, а также характерные для литературных вкусов эпохи барокко изысканные поэтические миниатюры, часто в форме акростиха. Один акростих Д. Туптало религиозного содержания нам известен.
В 1697 году, после смерти близкого его семье Иннокентия Монастырского, Д. Туптало принял игуменство киевского Кирилловского монастыря, а затем в сане архимандрита руководил Елецким монастырем в Чернигове.
Наступали новые времена. Московское царство возглавил энергичный, жаждавший обновления страны Петр I. Для проведения задуманных реформ он остро нуждался в образованных, преданных делу просвещения людях. В самом Московском государстве их явно не хватало, а доверить обновление церкви иноверцам, широко приглашавшимся на военную и другие виды светской службы, царь по политическим соображениям не мог.
Царь-реформатор, часто бывавший в Украине, начал активно привлекать к работе местное образованное духовенство, мало считаясь с желаниями и интересами избираемых им людей. Так случилось и с Д. Туптало, который, произведя своими обширными познаниями и духовным величием большое впечатление на царя, в 1700 году назначается на митрополичью кафедру Тобольска в Сибирь. Тогда Димитрий Туптало сумел уклониться от назначения, мотивируя отказ слабостью здоровья и необходимостью завершить работу над корпусом «Житий святых». Однако, приметив ответственного и просвещенного архимандрита, Петр уже не выпускал его из поля зрения. В конце концов Д. Туптало был вынужден принять царское назначение, но уже не за Урал, а в Центральную Россию.
В 1702 году по приказу Петра I он становится митрополитом Ростовским и Ярославским. На этом посту он прилагает большие усилия для развития системы образования во вверенной его попечению епархии и, будучи ревнителем православной веры, способствует укоренению в России духа открытости и толерантности по отношению к западной культуре. В местных школах он ввел обучение древнегреческому языку и латыни; содействовал открытию в Ярославле первого в России театра, способствовал завозу туда книг и развитию книгопечатания.
Многочисленные речи и проповеди митрополита, создание сети школ и библиотек, организация драматических представлений, диспутов и диалогов по принятой в Киево-Могилянской коллегии системе сыграли большую роль в просвещении края. На определенной ему царем должности он проявил большую энергию и одновременно уважительное отношение к национально-церковным традициям русского народа.
Здесь, на берегах Волги (жил он преимущественно в Ярославле), Димитрий Ростовский продолжал плодотворную литературную деятельность. Были закончены «Четьи-Минеи» — четырехтомный труд, содержавший жития православных святых. В работе над ним автор широко использовал не только отечественные источники, но и многочисленные греческие и латинские тексты. Еще одним его большим трудом стала «Летопись келейная», представляющая последовательное изложение событий библейской истории с нравственно-поучительными комментариями.
Пребывая в Ростовской земле, Димитрий Ростовский объехал весь Верхневолжский край, посещал многочисленные селения и скиты раскольников Заволжья. В отличие от многих сподвижников Петра, прибегавших к жестоким преследованиям и истязаниям раскольников, митрополит стремился понять и переубедить староверов. С этой целью он написал свой третий фундаментальный труд «Розыск о раскольнической брынской вере», изданный уже после его смерти. В этом труде выясняются причины появления раскола, определяются главные его направления и их идейные основания, описываются особенности быта и поведения старообрядцев. Это первое достаточно объемное и объективное описание убеждений и образа жизни раскольников и сегодня не утратило научной ценности.
Кроме трех капитальных трудов митрополит Ростовский был автором большого числа богословских и религиозно-философских («Рассуждение о образе Божии и подобии в человеке»), агиографических (жизнеописательных) и полемических произведений, духовных песнопений (кантов и псалмов), стихов и нескольких драм.