Осенью 1564 года венецианские купцы (агенты рыцарей в Стамбуле) сообщили, что в турки готовят огромную армию для отправки в Западное Средиземноморье. Их донесение было написано невидимыми чернилами из лимонного сока и спрятано на одном из кораблей среди купеческих счетов. Получив донесение, Великий магистр немедленно направил быстроходную галеру на Сицилию с письмом вице-королю. Он просит о помощи, но ему неведомо, что под самым носом у Ордена орудуют лазутчики турецкого султана Сулеймана Великолепного. Два инженера, славянин и грек, под видом рыбаков посетили Мальту, пересчитали все пушки, отметили расположение батарей, нанесли на карту размеры и систему укреплений острова. К этому времени Орден имел в своем распоряжении укрепленные города Биргу и Сенглеа и два форта — Сент-Анжело и Сент-Эльмо. Возведение последнего форта велось инженером, который хорошо знал свое дело. Форт представлял собой мощный, хорошо вооруженный бастион с сильными артиллерийскими позициями.
Ранним утром 18 мая со стен форта Сент-Эльмо рыцари увидели дале ко в море огромную турецкую армаду, которая состояла из 200 кораблей. Так началась «Великая осада Мальты», вписавшая, наверное, самую славную страницу в историю Ордена иоаннитов. Силы противоборствующи: сторон были явно неравны: на острове находились всего 600 рыцарей и 7000 солдат из вспомогательного войска и мальтийских ополченцев, а у турок было не менее 35 000 человек. Вся Европа следила за начавшимися военными событиями, а английская королева Елизавета сказала в те дни: «Если турки овладеют Мальтой, трудно даже предвидеть, какие опасности могут последовать для остальных христианских государств».
У Ордена мальтийских рыцарей было всего 8 галер и несколько вспомогательных судов, поэтому бессмысленно было идти навстречу турецкому флоту. Великий магистр, которому было тогда 70 лет, решил дать бой на суше на хорошо укрепленном острове, хотя общее число его защитников составляло всего 9000 человек.
На рассвете 19 мая 30-тысячная турецкая армия, состоявшая из янычар, под командованием сераскера Мустафы-паши прибыла на Мальту. Турецкий флот подошел к гавани Мерсамшетт, однако рыцари не могли помешать их высадке, так как не располагали достаточным количеством пушек. Основным же объектом атаки турок стал форт Сент-Эльмо, артиллерия которого контролировала два узких скалистых залива. Уже после первых турецких атак в форт было переброшено несколько сотен человек подкрепления и рота испанских аркебузиров, которые отбивали по несколько атак в день. Турки не смогли взять форт штурмом и поэтому начали готовить артиллерийские позиции для его обстрела. Несмотря на сильный огонь из крепости, они проложили в скалистой почве углубления, которые давали возможность обстреливать рыцарей из разного рода пушек. В результате этого внешние стены и укрепления форта превратились в развалины, и через несколько дней туркам удалось подойти к самым его стенам. Они решили пойти на приступ, однако нападение их было плохо подготовлено, осадные лестницы оказались короткими, и рыцарям удалось отбить атаку, забросав нападавших камнями и поливая их кипящей смолой.
В начале июня на помощь туркам подошел пират Драгут, начавший осаду Сент-Эльмо с организации его систематического обстрела. На мысе были сооружены новые артиллерийские позиции, кроме того, турецкие пушки были установлены и на оконечности полуострова Сиберас, который ограничивал вход в Большую гавань с другой стороны. Избранная Драгутом тактика быстро дала свои плоды: гарнизон форта, взвесив соотношение сил, решил, что сопротивление бесполезно. Однако против эвакуации решительно выступил Великий магистр Ла Валлетт, авторитет которого был столь велик, что весь орденский Капитул поддержал его. Когда защитникам Сент-Эльмо передали приказ Великого магистра защищаться до последней капли крови, среди них начался ропот. Более 50 рыцарей поставили свои подписи под обращением к Ла Валлетту, в котором заявляли: если Великий магистр хочет их гибели, они готовы вступить в бой с турками и честно в нем погибнуть.
Под покровом ночи из Биргу в форт переправилась комиссия, которой было поручено обследовать положение дел на месте. Ла Валлетт направил защитникам записку, в которой разрешал всем желающим покинуть форт, однако предание рассказывает, что ни один из оборонявшихся не покинул своего места. Комиссия решила, что форт еще можно защищать, и 11 ее членов решили лично возглавить оборону.