Не мысля хирургии без ежедневной практики, без оказания реальной помощи страждущим, Николай Иванович потребовал и получил в свое распоряжение военно-сухопутный госпиталь, который превратил в специализированную клинику госпитальной хирургии. Он стал первым в России профессором этого направления. Развитием нового направления в хирургии медицина также обязана Пирогову. С Академией и клиникой были связаны 15 лет неутомимого труда, поисков, открытий. Так как в обязанности Пирогова входило обучение военных хирургов, он в корне переработал многие хирургические методы и разработал ряд совершенно новых приемов, благодаря чему ему удавалось чаще, чем другим хирургам, избегать ампутации конечностей. Один из таких приемов до настоящего времени называется «операцией Пирогова».
Николай Иванович обладал не только несравненной и разнообразной техникой операций, но и имел необыкновенный дар преподавателя. На его лекциях в аудитории негде было и яблоку упасть: студенты-медики, литераторы, чиновники, военные, художники, инженеры и даже дамы. Его лекции газеты и журналы того времени сравнивали с концертами прославленной итальянской певицы Анжелики Каталани – так вдохновенно он говорил о разрезах, швах, гнойных воспалениях и результатах вскрытия.
Пирогов сделал хирургию наукой, разработал систему профилактики заражений, провел серию необычайно смелых операций, создал первый Анатомический институт и выступил с идеей пластических операций. Неутомимый исследователь дал классическое определение шока, изучил клинику тромбофлебитов, сепсиса, выделил особую форму «раневой чахотки», сотрясение мозга, местную асфиксию ткани, газовый отек. Фактически нет отдела хирургической патологии, всесторонне и объективно не изученного им. В лечении ран и воспалительных процессов Пирогов вплотную приблизился к антисептике, являясь, таким образом, предтечей Листера. Он также высказал мысль, что зараза передается от одного больного к другому. В борьбе с госпитальными инфекциями врач выдвинул на первый план чистый воздух и гигиенические мероприятия. Ему принадлежит знаменитое изречение: «Будущее принадлежит медицине предохранительной». Пирогов задолго до появления специального учения о витаминах понял значение дрожжей, моркови, рыбьего жира при лечении раненого и больного и выдвинул идею лечебного питания.
Когда Николая Ивановича назначили директором Инструментального завода, он разработал инструменты, которыми любой хирург сделает операцию качественно и быстро. Впервые в мире неутомимый исследователь создал образцовые по точности анатомические атласы. Свои исследования он проводил на замороженных трупах, распиливая их специальной пилой. Сам Пирогов называл это «ледяной анатомией». Атласом «Топографическая анатомия, иллюстрированная разрезами, проведенными через замороженное тело человека в трех направлениях» (в 4-х тт. 1851 – 1854 гг.) он положил начало новой науке, ставшей основой операционной хирургии и незаменимым руководством для врачей-хирургов. Хирург В. Разумовский о замороженных распилах писал: «Его гений использовал наши северные морозы на благо человечества. Пирогов с его энергией, свойственной, может быть, только гениальным натурам, приступил к колоссальному анатомическому труду… И в результате многолетних, неусыпных трудов – бессмертный памятник, не имеющий себе равного. Этот труд обессмертил имя Пирогова и доказал, что русская научная медицина имеет право на уважение всего образованного мира».
Помимо всех его многочисленных официальных должностей и обязанностей, Пирогов консультировал и оперировал в больницах для бедных, «почитая это своей первой и священной обязанностью». К нему со всех сторон тянулись люди, нуждавшиеся в помощи, но было у него и немало завистников и врагов, которым пришлись не по душе рвение и бескорыстие врача. Посвящая всего себя медицине, он долгое время не имел семьи. У него был горький опыт: он хотел жениться на дочери своего учителя Мойера, но им побрезговали. А он так нуждался в любви и счастье. В 1842 г. его избранницей стала Екатерина Дмитриевна Березина, девушка из родовитой, но сильно обедневшей семьи. Но она умерла на четвертом году супружества, оставив Пирогову двух сыновей, Николая и Владимира, который стоил ей жизни. При такой загруженности отца мальчики нуждались в матери. И ею стала «девушка с убеждениями», зачитывающаяся его статьями об идеале женщины, много и серьезно размышлявшая о жизни, любящая детей, – двадцатидвухлетняя баронесса Александра Антоновна Бистром. Теперь великий хирург мог всецело отдаться работе.
В 1846 г. произошло первое испытание эфирного наркоза. И хотя первенство здесь принадлежало Ф. Иноземцеву, именно Пирогов, отточив методику на животных, сделал наркоз достоянием широкой хирургии. А по собственной инициативе, принимая участие в военных действиях на Кавказе, он первым в истории медицины начал оперировать раненых на поле боя с эфирным обезболиванием. Пирогову также принадлежит идея о внутривенном наркозе, которая впоследствии была претворена в жизнь.