Первые серийные самолеты начали сходить со стапелей 22-го завода в Москве в начале 1936 года. К концу марта полностью завершились заводские и государственные летные испытания. Началась поставка машин в строевые части Военно-Воздушных Сил. Еще одно производство было развернуто в Иркутске на авиастроительном заводе № 125. Всего к моменту снятия самолета с производства в 1941 году было построено не менее 6 831 самолета: 5 695 – в Москве и 1 136 – в Иркутске. Еще 161 машина была выпущена в Чехословакии. Традиционно считается, что общий объем выпуска АНТ-40/СБ составлял 6 656 единиц. Эту цифру называли и в КБ Туполева. Однако в ходе исследования, которое мы провели, работая над книгой, выяснилось, что в данных, связанных с объемами выпуска самолетов, кое-что упущено. В результате, если построенные в Чехословакии самолеты раньше в подсчеты не включались, то мы решили добавить их к общему числу. Таким образом, всего было построено 6 995 самолетов, включая три опытных образца постройки завода опытных конструкций ЦАГИ. До этого совокупное число всех построенных самолетов Туполева (от АНТ-1 до АНТ-37) составляло лишь 2 084 машины. Ни один туполевский самолет по объему выпуска даже не приближался к АНТ-40.
В боевых действиях самолеты СБ-2 впервые приняли участие во время гражданской войны в Испании. Всего испанским республиканцам было поставлено морем двести десять СБ-2, первые машины поступили в октябре 1936 года. Поставки этих самолетов сразу же сказались на соотношении сил воюющих сторон: превосходство по маневренности и огневой мощи над большинством самолетов истребительной авиации крайне затрудняло борьбу с ними. После окончания гражданской войны моторы Климова на некоторых из поставленных в Испанию самолетов заменили на 12Ybr «Испано-Сюиза» французской постройки, и они до середины 40-х годов продолжали состоять на вооружении, сначала в строевых частях, а позднее в учебных авиаэскадрильях.
Когда в июне 1941 года началась Великая Отечественная война, самолеты СБ-2 составляли около 94 процентов боевого состава советской бомбардировочной авиации. Сразу после вторжения германской армии самолеты СБ-2 стали привлекаться к нанесению ударов по объектам противника, находившимся на территориях бывших союзников СССР. С их помощью в конце июня 1941 года был нанесен удар по захваченному «Люфтваффе» аэродрому близ города Демидов. 1 июля 1941 года группа в количестве тридцати девяти самолетов СБ-2, Пе-2 и И-153 в сопровождении истребителей прикрытия МиГ-3 уничтожила мост в районе города Скулен. В одной из июльских боевых операций группа из восемнадцати СБ-2 была атакована примерно тридцатью истребителями Me-109 «Мессершмитт». В продолжавшемся около получаса воздушном бою было сбито три Me-109. Потери советской авиационной группы составили один СБ-2. В другом бою в тот же день три бомбардировщика СБ-2 подверглись нападению двенадцати немецких истребителей, обе стороны потеряли по два самолета. В августе 1941 года в ходе восьмидневной операции самолеты СБ-2 каждую ночь совершали по три-четыре вылета для нанесения ударов по частям 2-й танковой группы германской армии, блокировавшей Ленинград. Бомбардировщики СБ-2 из состава 10-го гвардейского бомбардировочного авиаполка активно участвовали в Сталинградской битве, нанося бомбовые удары по аэродромам и районам дислокации пехоты и танков противника.
Надо сказать, что боевое применение СБ-2 не ограничивалось выполнением только бомбардировочных задач. Они использовались как транспортные и связные самолеты для организации сообщения между штабами Красной Армии и фронтом, буксировали планеры, доставлявшие войска и предметы снабжения в тыл противника, выполняли разведывательные полеты, а при необходимости могли поднимать в воздух прожекторные установки, которые использовались для подсветки самолетов противника во время авианалетов на Москву: это облегчало работу наземных зенитных установок.
История хранит несколько эпизодов, когда летчики направляли подбитые СБ-2 на противника. 22 июня 1941 года летчик 16-го скоростного авиабомбардировочного полка капитан А.С.Протасов, самолет которого в воздушном бою получил сильные повреждения пушечным огнем немецкого бомбардировщика, таранил и уничтожил своего противника. Через несколько дней 4 июля командир эскадрильи 10-го бомбардировочного авиаполка 41-й бомбардировочной авиадивизии капитан Л.В.Михайлов, СБ-2 которого был подбит огнем зениток, направил падающую машину на танковую колонну фашистов и уничтожил несколько танков. Оба советских летчика в этих эпизодах погибли.