Биологически активные

такие концы в отличие от «липких» называются «тупыми». Есть и ферменты, сшивающие два тупых конца, однако эта процедура реализуется труднее. Если генетическому инженеру требуется сшить два фрагмента ДНК, обладающих «липкими», но некомплементарными концами, —

  …ТЦАТЦЦА                 ГГАТ…

  …АГТ                 ЦТАГЦЦТА…

он использует синтетический переходник, или «линкер», — небольшой кусочек двойной спирали с соответствующими «липкими» концами:

…ТЦАТЦЦА     ГГЦТГГАТЦ     ГГАТ…

…АГТ       АГГТЦЦГАЦ   ЦТАГЦЦТА…

Методы избирательного разрезания и сшивки двутяжевых нитей ДНК — лишь часть средств из арсенала генетической инженерии. Чтобы «пришить» в определенном месте фрагмент ДНК, соответствующий аминокислотной последовательности интересующего нас белка, нужно этот фрагмент иметь. В некоторых случаях (сравнительно короткие белки) это удается сделать методами химического синтеза. Можно также попытаться выделить соответствующие фрагменты ДНК из клетки, в которой происходит синтез соответствующего белка, но осуществить это практически очень трудно: содержание ДНК слишком мало. Кроме того, в геноме высших организмов участки, кодирующие аминокислотную последовательность некоторого белка, перемежаются вставками-интронами. После синтеза соответствующей молекулы информационной РНК происходит ее созревание — удаление интронов. В клетках же бактерий, которые почти исключительно используются для получения белков методами генетической инженерии, созревание РНК не происходит и, соответственно, не может быть получена нужная аминокислотная последовательность.

Поэтому наибольшее распространение получили методы ферментативного синтеза искомых фрагментов ДНК на матрице соответствующей информационной РНК, выделенной из клеток, продуцирующих нужный белок. Такой процесс, как упоминалось, называется обратной транскрипцией и осуществляется ферментом ревертазой. Чтобы ревертаза могла начать такую работу, ей нужен затравочный фрагмент ДНК — короткий участок, комплементарный началу молекулы информационной РНК.

Таким образом, получается однонитевая ДНК, «достройка» второй, комплементарной цепочки осуществляется с помощью той же ревертазы или ДНК — полимеразы. Также и здесь необходима затравка — олигонуклеотид, комплементарный начальному участку.

Но вот ген, кодирующий аминокислотную последовательность белка, получен. Если, однако, его поместить теперь в клетку, он скорее всего просто будет уничтожен ферментами, да если и уцелеет (это бывает в некоторых случаях), не будет вовлечен ни в процессы репликации, ни транскрипции. Чтобы он мог участвовать в этих процессах, необходимо встроить его в более протяженную последовательность, включающую специфический участок, ответственный за процесс репликации, — репликатор. Кроме того, отбор клеток, продуцирующих чужеродный белок, удобнее производить не путем контроля содержания самого белка, часто это затруднено технически, а по присутствию какого-нибудь сцепленного с ним фактора — фермента или антибиотика.

Соответствующий генетический материал тоже должен содержаться во вводимой в клетку чужеродной ДНК. Обычно это кольцевая ДНК, называемая на жаргоне генетических инженеров вектором. Именно для ее получения («конструирования», как говорят профессионалы, коль уж инженерия, так инженерия) используются описанные выше приемы ферментативного разрезания и сшивки ДНК. В результате в плазмиду из кишечной палочки встраивается кусочек генома человека (подумайте, что за странный гибрид!), полученная таким образом рекомбинатная плазмида вводится в клетку все той же кишечной палочки, и та вовсю начинает производить человеческий белок, например, все тот же инсулин.

Пример, впрочем, не самый удачный, потому что, строго говоря, никакого инсулина в готовом виде эта клетка не производит. Молекула инсулина, как упоминалось, состоит из двух цепей: более короткой А и более длинной В; в животном же организме сначала синтезируется проинсулин — единственная цепь, N-концевая последовательность которой представляет собой В-цепь, С-концевая — A-цепь, а между ними расположен соединительный фрагмент, который впоследствии выщепляется.

Для получения инсулина с использованием методов генетической инженерии были использованы два подхода. Первый предполагал синтез все же проинсулина (или сходного белка, содержащего вместо С-пептида иную аминокислотную последовательность) и последующую его конверсию в инсулин химическим путем. Второй подход базировался на получении отдельно А- и В-цепей и «сборку» из них молекулы инсулина; именно такая схема использована для получения упоминающегося коммерческого препарата. И в том и в другом случае необходимо преодолеть весьма значительные трудности, которые, впрочем, уже не имеют отношения к собственно генетической инженерии.

Инсулин, как упоминалось, был первым белковым гормоном, первым белком вообще, который стали получать в коммерческих целях методами генетической инженерии.