Болезни печени

Иммуноферментный анализ (ИФА) — является универсальным методом иммунологической диагностики, который широко используется на практике. Он предназначен для выявления вирусных белков (антигенов) или антител, которые вырабатываются иммунной системой в ответ на проникновение вирусов в организм человека. Эти белки являются своеобразными маркерами (метками) или признаками, наличие которых позволяет поставить точный диагноз, оценить характер заболевания, помочь лечащему врачу выбрать правильное лечение. Этот метод основан на известном взаимодействии «антиген-антитело».

Для определения антигенов различные коммерческие фирмы выпускают тест-системы, которые представляют собой 96-луночные полистироловые планшеты. На дно лунок заранее сорбируют («пришивают») антитела к тому или иному антигену возбудителя, например, к поверхностному антигену вируса гепатита В — HBs-антигену. На первом этапе в каждую лунку добавляют образец, например, сыворотку крови больного в разных разведениях, содержащую пока не определенный вирусный белок (антиген). Если этот белок (антиген) «узнал» свое антитело, то происходит их связывание. Это означает, что сыворотка больного содержит тот антиген, антитела к которому сорбированы на дне планшетки. Для того чтобы увидеть результаты этой реакции, существует следующая стадия, на которой к комплексу «антиген-антитело» добавляют соединение, которое связывается с антителом. Это соединение содержит фермент, например, пероксидазу хрена. При добавлении к нему субстрата происходит расщепление последнего с последующим окрашиванием раствора в желто-коричневый цвет.

На следующей стадии проводят тщательную промывку каждой лунки от непрореагированных компонентов. В тех лунках, где антиген, как в нашем случае, полностью связан с антителом, он уже не может взаимодействовать с добавляемым соединением. Поэтому оно удаляется из лунки при отмывании. По мере разведения сыворотки содержание в ней антител снижается, и они уже не в состоянии полностью связать антиген. В этих лунках соединение, содержащее фермент, связывается с антигеном и остается в лунке после промывания. На следующей стадии добавляют субстрат и смотрят результаты реакции, которые оценивают визуально или с помощью спектрофотометра.

Таким образом, мы выявили, что в образце сыворотки от больного содержится HBs-антиген. Можно также выяснить его количество или титр, определив то последнее разведение сыворотки, где появилось желтое окрашивание. Чем больше степень разведения, тем больше вируса содержится в крови больного.

Подобным образом можно определить наличие антител к тому или иному возбудителю вирусного гепатита. Только в этих случаях используют диагностические тест-системы с «пришитыми» на дно лунок не антителами, а известными антигенами. Достоинствами этого метода являются высокая чувствительность и специфичность, простота постановки реакции, возможность обследования одновременно большого количества пациентов. Среди недостатков метода можно отметить необходимость специального дорогостоящего оборудования и соответствующей квалификации персонала.

Метод полимеразной цепной реакции — это молекулярная клиническая диагностика. Она включает в себя определение белков (антигенов), а также нуклеиновых кислот (или их характерных участков) — возбудителей разных заболеваний. Она начала особенно интенсивно развиваться в начале 1970-х годов после фундаментальных открытий в области молекулярной биологии (создание моноклональных антител и открытие в 1985 году метода ПЦР). Эти достижения существенным образом изменили содержание всей молекулярной клинической диагностики.

В современной лабораторной диагностике ПЦР занимает особое место. Метод ПЦР поднял клиническую лабораторную диагностику па принципиально иную высоту — уровень определения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации в любой биологической среде.

При этом способом ПЦР теоретически может быть обнаружена одна искомая молекула нуклеиновой кислоты среди миллионов других. С точки зрения клинической медицины определение нуклеиновой кислоты равнозначно обнаружению возбудителя в объекте исследования.

Из биологии известно, что нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК) обладают свойством к саморепродукции (воспроизводству). Этот принцип и лежит в основе метода ПЦР, когда этот процесс осуществляется искусственно в лабораторных условиях. Для этого из полученного от больного образца ткани (например, в случае подозрения на вирусный гепатит) выделяют сначала нуклеиновую кислоту. Она выполняет роль своеобразной «матрицы», на которой осуществляется синтез. Нуклеиновая кислота имеет свой «отпечаток» — уникальную последовательность нуклеотидов, из которых она состоит. Для каждого возбудителя такая последовательность изучена, составлена своеобразная «карта».