В настоятельницы обители Елизавету Федоровну посвятил митрополит Московский Владимир. Доподлинно неизвестно, была ли она пострижена в монахини. В «Православной энциклопедии» под общей редакцией патриарха Московского и всея Руси Алексия II сказано, что Елизавета Федоровна монашеского пострига не принимала. Однако на официальном сайте Русской православной церкви говорится, что
Правила обители были не так строги, как в монастыре. Многие сестры являлись урожденными дворянками.
Требования общины к сестрам заключались в прочном духовном настроении и желании в смирении и терпении нести всякое возлагаемое на них послушание во имя Господа. На период служения они приносили обеты целомудрия, нестяжания и послушания, но потом каждая из них могла покинуть обитель и выйти замуж. Елизавета Федоровна пыталась воспитать особых сестер, которые бы помогали и утешали самых безнадежных больных людей, стоящих на краю могилы. Главной целью сестер была помощь нуждающимся, которым оказывалась материальная, медицинская, духовная и другая поддержка. Люди либо лично обращались с просьбами, либо бросали записочки в специально оборудованный в углублении стены ящик. В течение года поступало более десяти тысяч записок, и все они проверялись сестрами милосердия. Углубление в стене, куда помещали записки, до сих пор сохранилось.
На территории обители была небольшая больница, в которой безвозмездно лечили и давали лекарства всем, кому это было необходимо. Ежедневно сюда приходило до нескольких сотен нищих и калек. Лучшие хирурги работали в обители бесплатно и обучали медицине сестер. Часто сестры помогали нуждающимся и разделяли их скорби вне стен обители – в самых грязных, безотрадных и забытых уголках Москвы. С XIX века в Москве была известна Хитровская площадь – скопление преступников, безработных и нищих.
Еще при обители действовали воскресная школа, бесплатная столовая, библиотека, курсы сестер милосердия и лекторий, в котором читались духовно-нравственные лекции. Помимо службы в больнице сестры преподавали в приюте, работали в просфорнях, аптеках и мастерских, где шили одежду для нищих. Елизавета Федоровна никогда не обременяла сестер и самую трудную работу неизменно брала на себя. Утомленная тяжелыми дневными делами, она и ночью, если было необходимо, оставалась у постели больного или посещала ночные службы.