На двадцатом году в душевной жизни Ливингстона произошла перемена, имевшая влияние на всю его судьбу. Еще с двенадцати лет он серьезно размышлял о своей греховности и считал себя недостойным к восприятию божественной благодати. Наконец наступило время, когда он почувствовал эту благодать в своей душе вместе с непреодолимым желанием посвятить себя служению Богу. Новую душевную жизнь, пробудившуюся в нем, он сравнивает с обращением апостола Павла, Блаженного Августина и других. Стремление исполнить завет Христа – «положить душу свою за людей» – определило его призвание. Он не сразу напал на мысль самому сделаться миссионером и сперва только отдавал обществу миссионеров все, что оставалось у него от удовлетворения необходимых жизненных потребностей. Намерение сделаться миссионером явилось у него на двадцать первом году, после прочтения воззвания миссионера Гюцлафа, обращенного к английским и американским церквам относительно христианского просвещения Китая; с тех пор вся его энергия была направлена к осуществлению этого намерения. Когда он сообщил о нем духовнику и родителям, они ответили ему полным одобрением.
Ливингстон не хотел ограничить подготовку к деятельности миссионера одним изучением богословских наук и решился, кроме того, пройти курс врачебного искусства, чтобы быть еще более полезным для будущей паствы. Изучение медицины было сопряжено с большими затратами, но предстоявшие денежные затруднения не остановили Ливингстона; он работал в течение шести летних месяцев для того, чтобы приобрести возможность во время зимнего семестра оплачивать свою жизнь в городе и слушание лекций. С помощью отца он отыскал себе комнату в Глазго, стоившую два шиллинга (90 коп.) в неделю. К концу семестра, в апреле 1837 года, молодой человек возвратился в Блентайр и продолжал работать на фабрике; но ему все-таки не удалось собрать нужную сумму на следующий семестр, и недостававшую часть ее он занял у брата. В первые два семестра Ливингстон слушал лекции греческого языка и богословия в университете и лекции медицинских наук в Андерсеновской коллегии; последние стояли для него на первом плане. В это время он сблизился с профессором физиологии Бьюкэненом, профессором химии Грегэмом и в особенности с ассистентом последнего Джемсом Юнгом, дружбу с которым сохранил в течение всей своей жизни.
Во втором семестре (1837—1838 годы) Ливингстон обратился к Лондонскому миссионерскому обществу с предложением своих услуг в качестве миссионера. В письме к лицам, заведующим обществом, он высказывает свое отношение к деятельности, которую искал для себя. «Прежде всего, – говорит он, – миссионер должен всеми зависящими от него средствами: путем проповедей, поучений, бесед, образования юношества – распространять евангельские истины, по мере возможности вносить в ту среду, где он находится, искусства и науки цивилизации и употреблять все усилия, чтобы христианство становилось доступнее сердцу и совести просвещаемых». Он не скрывает от себя всех трудностей, опасностей и испытаний, какие неизбежно встречают миссионера на его пути, и изъявляет полную готовность подвергнуться им, в надежде на помощь Божию, причем добавляет, что он не женат и не думает жениться, так как не хочет, чтобы семейные заботы отвлекали его от выполнения предстоящего ему долга.