8 мая 1988 года стала одной из участниц создания первой оппозиционной партии в СССР «Демократический Союз». С 1988 года регулярно выступала в нелегальной газете московской организации ДС «Свободное слово», в 1990 году одноименное издательство газеты выпустило сборник ее статей.
В сентябре 1990 года после публикации в партийной газете «Свободное слово» статьи под заголовком «Хайль, Горбачев!» и выступлений на митингах, где она разрывала портреты Михаила Горбачева, обвинялась в публичном оскорблении чести и достоинства Президента СССР и оскорблении государственного флага.
В 1990 году крестилась. Принадлежала к Украинской автокефальной православной церкви, выступая с резкой критикой РПЦ.
В мае 1991, январе и августе 1995 года против Новодворской возбуждались уголовные дела, прекращенные за отсутствием состава преступления.
В конце 1992 года Новодворская и часть членов ДС создали организацию Демократический союз России (ДСР). В сентябре 1993 года после издания антиконституционного указа президента Бориса Ельцина о роспуске Съезда народных депутатов и Верховного Совета РФ была одной из первых, кто поддержал этот указ. Организовывала митинги в поддержку президента. После штурма здания Верховного Совета войсками, верными Ельцину, Новодворская угощала на улице прохожих шампанским в честь победы Ельцина над Съездом и парламентом.
В октябре 1993 года участвовала в учредительном съезде блока «Выбор России». Собиралась баллотироваться в Иваново, но не смогла собрать необходимое число подписей.
19 марта 1994 года Краснопресненская прокуратура начала проверку деятельности Валерии Новодворской по статьям 71 и 74 УК РФ (пропаганда гражданской войны и разжигание межнациональной розни) из-за ряда статей, опубликованных в газете «Новый Взгляд». 27 января 1995 года из-за них Генеральной прокуратурой РФ было возбуждено уголовное дело. 8 августа 1995 года прокуратурой Центрального округа Москвы дело было прекращено за отсутствием в ее действиях состава преступления.
В июне 1994 года участвовала в учредительном съезде партии «Демократический выбор России».
14 августа 1995 года Московская городская прокуратура возбудила очередное уголовное дело против Новодворской. Поводом послужила листовка, написанная Новодворской к пикету ДСР 8 апреля. Дело было передано в Останкинскую прокуратуру, которая не нашла в листовке состава преступления.
В декабре 1995 года на выборах в Госдуму 2-го созыва Новодворская вошла в избирательный список Партии экономической свободы. Кроме этого, Новодворская зарегистрировалась в одномандатном округе № 192 Москвы, но выборы проиграла и в Госдуме 2-го созыва (1995–1999) была помощником депутата Константина Борового.
11 марта 1996 года Московская городская прокуратура отменила решение прокуратуры Центрального округа Москвы от 8 августа 1995 года о прекращении дела (№ 229120) в отношении Новодворской. Дело было направлено для повторного расследования в прокуратуру Северо-Восточного округа Москвы.
10 апреля 1996 года Валерии Новодворской было предъявлено обвинение по статье 74-й, части 1-й (умышленные действия, направленные на разжигание национальной розни). Перед выборами Президента РФ поддерживала кандидатуру Григория Явлинского. После первого тура выборов, вместе с Демократическим союзом России, предложила лидеру «Яблока» «немедленно и без всяких условий отдать голоса своих сторонников Борису Ельцину».
22 октября 1996 года Московский городской суд отправил на доследование дело № 229120 в отношении Валерии Новодворской.
В конце августа 2008 года на время отлучена от эфира радиостанции «Эхо Москвы» за слова о Шамиле Басаеве, которые главный редактор радиостанции Алексей Венедиктов посчитал оправданием терроризма. Когда чуть позднее в своем блоге Валерия Новодворская назвала Басаева «нелюдью», проблема была исчерпана.
В марте 2010 года подписала обращение российской оппозиции «Путин должен уйти». В 2013 году совместно с Константином Боровым приступила к созданию партии «Западный выбор».
В последние полгода своей жизни Валерия Новодворская поддерживала Евромайдан, курс Украины на вступление в Европейский союз и свержение с поста Президента Украины Виктора Януковича и правящей «Партии регионов».
15 марта 2014 года приняла участие в Марше мира в Москве против вооруженного вмешательства российских властей во внутренние дела Украины. Новодворская вышла с плакатом «Банда Путина, геть в Нюрнберг». В марте 2014 года записала видеообращение к активистам украинского «Правого сектора», в котором призывала их активнее влиять на новое украинское правительство, чтобы противостоять России. По мнению следователя МВД РФ в отставке Павла Карпова, распространенное в Интернете обращение Новодворской к Дмитрию Ярошу является публичным призывом к осуществлению экстремистской деятельности, разжигает ненависть и вражду.