ДНК. История генетической революции

В конце концов, проект «Геном человека» не требовал разрабатывать с нуля совершенно новые методы анализа ДНК; речь шла, скорее, об оптимизации и автоматизации уже имеющихся методов, что постепенно позволило секвенировать пары оснований сначала сотнями, затем тысячами, а потом миллионами. Ключевую роль в проекте сыграл революционный метод генерации нужных сегментов ДНК в огромных количествах – метод амплификации. Для проведения секвенирования нужно было иметь много экземпляров того гена, который мы собирались изучать. До середины 1980-х годов амплификацию того или иного участка ДНК можно было выполнить лишь молекулярным клонированием по методу Коэна – Бойера: вырезали нужный сегмент, внедряли его в кольцевую плазмиду, затем видоизмененную плазмиду вставляли в бактериальную клетку, которая затем делилась, и при каждом делении у нас появлялся новый экземпляр нужного сегмента ДНК. После того как бактерии размножатся, мы вычленяли нужный сегмент из общей массы ДНК в бактериальной культуре. Со времени первых экспериментов Коэна и Бойера эта процедура была доработана, но все равно оставалась неудобной и затратной по времени. Огромным скачком вперед стало изобретение полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая позволяла выполнить селективную амплификацию нужного фрагмента ДНК всего за пару часов, вообще без всякой возни с бактериями.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была изобретена в 1983 году биохимиком Кэри Муллисом, работавшим в компании Cetus. Открытие этой реакции было весьма примечательным. Позже Муллис вспоминал: «Однажды пятничным вечером в апреле 1983 года меня словно озарило. Я был за рулем, катил по залитой лунным светом извилистой горной дороге в Северную Калифорнию, край секвойных лесов». Впечатляет, что именно в такой ситуации его посетило вдохновение. И дело совсем не в том, что на севере Калифорнии особенные дороги, способствующие озарению; просто его друг однажды видел, как Муллис безрассудно мчался по обледенелой дороге с двусторонним движением и это его совершенно не смущало. Друг рассказал New York Times следующее: «Муллису привиделось, что он погибнет, врезавшись в секвойю. Поэтому он ничего не боится за рулем, если вдоль дороги не растут секвойи». Наличие секвой вдоль дороги заставляло Муллиса сосредоточиться и… вот оно, озарение. За свое изобретение в 1993 году Муллис получил Нобелевскую премию по химии и с тех пор стал еще более странным в своих поступках. Например он является сторонником ревизионистской теории о том, что СПИД не связан с ВИЧ, чем значительно подорвал собственную репутацию и помешал врачам.

ПЦР – довольно простая реакция. Для ее проведения нам требуется два химически синтезированных праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК. Праймеры – это короткие участки однонитчатой ДНК, каждый примерно по 20 пар оснований в длину. Особенность праймеров такова, что они соответствуют участкам ДНК, которые требуется амплифицировать, то есть ДНК-матрице.

Кэри Муллис, изобретатель ПЦР

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка. Фактически полученная «матрица» представляет собой цельный геном, и наша цель – выделить из нее интересующие нас фрагменты. Для этого двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 95 °C на несколько минут, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. ДНК-полимераза начинает репликацию ДНК, связываясь с отрезком цепи нуклеотидов. Фермент ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки или примера для копирования. В результате первого цикла получаем многократное последовательное удвоение определенного участка ДНК. Далее мы повторяем эту процедуру. После каждого цикла получаем участок-мишень в двойном количестве. Спустя двадцать пять циклов ПЦР (то есть менее чем через два часа) имеем интересующий нас участок ДНК в количестве, в 2²⁵ раза превышающем исходное (то есть мы амплифицировали его примерно в 34 миллиона раз). Фактически на входе у нас получалась смесь из праймеров, матричной ДНК, фермента ДНК-полимеразы и свободных оснований А, Ц, Г и Т, количество специфического продукта реакции(ограниченного праймерами) растет экспоненциально, а количество «длинных» копий ДНК линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует.

Амплификация нужного участка ДНК: полимеразная цепная реакция