Литва вынуждена была в 1503 году просить перемирия. По этому перемирию древнерусские города и земли назывались уже не «отчиной» (собственностью), а только «землями» Литвы. За Россией были оставлены, обширные княжества: Чернигово-Стародубское и Новгород-Северское, а также город Любеч на Днепре и город Путивль на речке Сейм. В этой части России границы её подходили к Днепру. Киев отстоял теперь в 40–50 км от русской границы, что имело важное стратегическое значение. Так в начале XVI века Российское государство сделало первую попытку начать воссоединение русского этноса.
И после этого русское правительство продолжало напоминать Литве и Польше о возвращении всех захваченных ими древнерусских земель. Все эти земли объявлялись «отчиной» Руси на основании как этнической принадлежности их населения, так и их прошлого. «Не то одно наша отчина, коя городы и волости ныне за нами: и вся Русская земля, Киев и Смоленск и иные городы, которые он за собою держит к Литовской земле… из старины… наша отчина». «Каждому отчизна своя мила и каждому своего жаль», — объясняли русские дипломаты литовским правителям.
В 1507 г. возобновилась война с Литвой. Население в Белоруссии и на Киевщине под руководством бояр Глинских (1508 г.) восстало против господства Литвы за переход этих земель в состав России. По миру 1508 г. Чернигово-Северская земля осталась за Россией.
Не забывают в России и Галицию. В 1563 году послам короля Сигизмунда II Августа было предъявлено требование возвратить России все русские земли. Русское правительство составило полный список городов, которые оно требовало возвратить, в том числе и галицийские — Перемышль, Львов и Галич. Этот вопрос русское правительство считало для себя настолько важным, что в ходе переговоров в течение нескольких месяцев не снимало его с обсуждения.
Обосновывая свои права на эти города, правительство объясняло, как они были отторгнуты: «… а те городы, — заявляли русские дипломаты, — искони русских государей… а зашла та вотчина за государя вашего… некоторыми незгодами после Батыева пленения, как безбожный Батый многие грады русские попленил, и после того потому от государей наших… те городы поотошли».
Переселения малороссов в Северо-восточную Русь, которые начались в XIV веке, не прекращались и в XVI веке. Однако теперь в этом движении появился ряд новых черт. Если в XIV–XV веках переходили феодалы, присоединяя свои земли к Московскому княжеству или поступая на службу со своими людьми, и переселялись одиночки — беглые крестьяне и горожане, то в XVI веке наблюдаются уже массовые переселения в пределы Российского государства малороссов, в первую очередь, казаков.
Вместе с выходцами из великорусских земель казаки собирались в «диком поле» пограничья, предлагая правительству свои услуги в качестве служилых людей, заявляя о своей готовности нести пограничную службу, защищать рубежи Российского государства. Так, в 1589 г. на речку Северский Донец переселилось около 700 казаков. Здесь следует отметить, что приём казаков на пограничную службу впервые введён был в Российском государстве задолго до создания реестрового казачества польским правительством.
После Люблинской унии в 1569, когда Малороссия стала юридически подчинённой Польше, на южнорусских землях началась политика ополячивания русских. В 1596 г. на специально созванном польским королём Сигизмундом III церковном соборе в Бресте была официально объявлена церковная уния, вошедшая в историю под названием Брестской. Уния провозглашала подчинение православной церкви католической и признание папы римского главой униатов. Православная церковь объявлялась еретической. Против православного духовенства стали применять репрессии. Брестская уния должна была окончательно разорвать и церковные связи Западной Руси с Россией.
В борьбе с католицизмом и ополячиванием в это время в Малороссии возникла значительная полемическая литература, в издании которой большую роль сыграли братства: организации оппозиционно настроенных к Польше горожан. С особой остротой и горячностью обличал ренегатов афонский монах-публицист, уроженец Львова Иван Вишенский. В ряде своих произведений («Послание до епископов» и др.) Вишенский выступает за свободу «Руси», «Малой России», «народа русского», за «народу русского вольности».
О двух частях «народа росского» — «Великой России», которая «и до селе квитнет» (цветёт), и о «Малой России», составляющих единое целое, говорится, например, в произведении Архимандрита Киево-Печерской Лавры Захарии Копистенского «Палинодия или Книга Обороны святой апостолской Всходней церкви» (1619–1622 гг.). В ней архимандрит с гордостью рассказывает об успехах Российского государства как о «сильном муре (стене) медяном», о Москве, где «суть люде мудрий».