Генетический детектив. От исследования рибосомы к Нобелевской премии

Мы хотели разобраться, как рибосома «узнает», что пора остановиться. В конце кодирующей последовательности находится один из трех стоп-кодонов (UAA, UAG или UGA), каждый из которых не соответствует какой-либо аминокислоте, а сигнализирует, что достигнут конец последовательности. Когда один из этих стоп-кодонов входит в А-сайт рибосомы, он распознается факторами терминации трансляции, которые связываются с рибосомой и «отрезают» свежий белок от тРНК. У бактерий два таких фактора, именуемых RF1 и RF2. Вопрос был фундаментальным: как рибосома выпускает готовый белковый продукт?

Мы чуть не опоздали. Сабина написала нам, что на конференции в районе бухты Сан-Франциско представитель группы Гарри сообщил, что они расшифровали структуру рибосомы с RF1, распознающим стоп-кодоны UAA и UAG. Сотрудники Гарри отвергли ими же полученную кристаллическую форму, которую сами яростно защищали на конференции в Кейп-Коде, и просто воспроизвели нашу, но, избежав той ошибки, которую мы допускали при замораживании. Предполагаю, что это в конечном итоге был комплимент, но до сих пор обидно.

Мы сломя голову принялись за аналогичную задачу – добиться того же с RF2, распознающим UAA и UGA. Идея была такова: располагая двумя факторами терминации трансляции, определить, как они отличают три стоп-кодона от шестидесяти одного оставшегося, то есть тех, которые кодируют аминокислоты и распознаются тРНК.

Альберт, лучше всех нас разбиравшийся в кристаллографии 70S, возглавил эту работу. Ему помогала Хонг, указавшая мне на проблему. Как и прежде, в деле участвовала вся лаборатория. На этот раз к нам присоединились аспиранты Кай Нойбауэр и Ребекка Вурхис.

Кай приступил к проработке проблемы, весьма опосредованно связанной с основным путем трансляции: стал выяснять, как рибосомы выручаются специальной молекулой, когда застревают в дефективной мРНК, например, в такой, где не хватает стоп-кодона. Спокойный и серьезный молодой человек, студенческие годы проведший в Германии, был дипломатичен и всем нравился. Часто он выступал посредником, когда в лаборатории случались конфликты.

Ребекка приехала из Йеля, где училась под руководством Скотта Стробела (того самого, который проделал огромную работу, выясняя, как рибосома образует пептидную связь). Стробел сообщил мне, что Ребекка получала более лестные отзывы, чем многие его постдоки. Странно, что изначально она прибыла к нам для учебы по годичной магистерской программе, после чего собиралась вернуться в свой медицинский вуз в США. Тем более необычно, что она пришла к нам с собственным проектом по связыванию двух тРНК веществом, которое имитирует две аминокислоты с пептидной связью. Мы могли поймать рибосому прямо в момент образования пептидной связи, этот проект не удался. Несмотря на неудачу, Ребекка осталась на десять лет в LMB, а уже затем уехала в США, где получила штатную преподавательскую должность в Калтехе.

К счастью, журнал Science был заинтересован в публикации нашего «сюжета» о факторах терминации трансляции, и нам удалось составить вполне достойную статью о том, как RF2 связывается с рибосомой. На ту же тему параллельно поступили статьи из лаборатории Гарри.

Но к тому моменту сразу в нескольких лабораториях удалось воспроизвести кристаллы, открытые Марией. Так, допустив ошибку с магнием, мы проиграли наше почти двухгодичное лидерство, а работа с новыми кристаллами стала всеобщим достоянием.

Имевшиеся у нас кристаллы не годились для ответа на вопрос: доставляются ли тРНК к рибосоме, или тРНК и мРНК проникают через нее. На этих этапах процесс катализируется факторами ГТФазы EF-Tu и EF-G, которые гидролизируют ГТФ, тем самым обеспечивая ход рибосомной машины. Из таких кристаллов выступает белок L9, связывающийся с соседней рибосомой в кристалле, блокируя связь с любыми факторами ГТФазы. Мы оказались перед очередной преградой.

Пару лет назад, когда мы впервые обнаружили эту проблему, я подумал, что неплохо было бы просто удалить ту часть гена, что отвечает за L9. Однажды утром я явился в лабораторию и озвучил свою блестящую идею. Фрэнк рассмеялся и со своим фирменным сарказмом отметил, что я слегка опоздал. Оказалось, что Мария уже успела заказать нужные фрагменты ДНК, чтобы генетически смоделировать такое удаление. Они с Альбертом вывели новый штамм Thermus, в котором отсутствовал этот белок.

Увы, когда они попытались кристаллизировать мутантов в тех же условиях, что и рибосомы от естественного штамма Thermus, у них не получилось вообще никаких кристаллов. Требовалось подобрать новые условия, причем желательно, чтобы кристаллы были связаны с одним из факторов. Перед уходом Фрэнк сказал, что сделал ряд безуспешных попыток подбора условий.