Геном человека

Большой удачей для экспериментаторов было то, что в большинстве случаев при нарезании рестриктазами ДНК образующиеся фрагменты содержат «липкие» концы, т. е. способны в дальнейшем соединяться друг с другом. Для восстановления химической связи таких слипшихся фрагментов стали использовать еще один новый класс ферментов — лигазы. Так появились первые инструменты, позволяющие целенаправленно манипулировать с молекулами ДНК in vitro. Следующий важный этап — размножение сконструированных рекомбинантных ДНК, чтобы можно было с ними работать дальше. Для этой цели стали использовать специальные ДНК — векторы, которые представляют собой или бактериофаги, или внехромосомные кольцевые молекулы — плазмиды, которые обладают способностью размножаться в бактериальных клетках. Если любой фрагмент ДНК внести в состав ДНК бактериофагов или плазмид, то при переносе в бактериальные клетки он будет там размножаться вместе с вектором. Наконец, были разработаны специальные подходы для отбора бактериальных клеток, в которых содержатся необходимые рекомбинантные ДНК. Все эти достижения позволили проводить клонирование ДНК, т. е. выделять из сложной смеси молекул определенные участки ДНК и размножать их.

Клонирование фрагментов ДНК дало в руки исследователей принципиально новый подход к выделению из сложной смеси ДНКовых фрагментов конкретных индивидуальных последовательностей. При этом они могли содержать осмысленные тексты (гены) или не содержать таковых. Традиционная биохимия не могла обеспечить подобную процедуру в силу того, что различные фрагменты ДНК химически очень сходны. Но генной инженерии это оказалось вполне под силу. Схематически процесс клонирования ДНК изображен на рис. 13.

^{Рис. 13. Схема процесса клонирования ДНК с использованием в качестве вектора бактериальной плазмидной ДНК}

После разрезания ДНК на фрагменты с помощью рестриктазы все они соединяются ковалентно с вектором (вектор разрезан той же рестриктазой) в результате «слипания» концов молекул и последующей обработки «гибридов» лигазой. Так в пробирке создается искусственная или рекомбинантная ДНК. Затем осуществляют перенос множества образовавшихся рекомбинантных молекул в бактериальные клетки — трансформацию. Особенность процесса трансформации заключается в том, что в одну бактериальную клетку попадает лишь одна рекомбинантная молекула ДНК. После этого, благодаря отбору, размножаются только бактерии с рекомбинантными ДНК, содержащими требуемые нуклеотидные последовательности.

Для изучения структуры генома необходимо не только клонировать все его участки в виде рекомбинантных молекул, но, главное, расшифровать в них последовательность нуклеотидов, т. е. «прочесть» ДНКовый текст.

Важным моментом во всей этой генно-инженерной «кухне» было создание принципиально новой технологии размножения индивидуальных фрагментов ДНК in vitro. Этот удивительно простой метод получения фрагментов ДНК в неограниченном количестве копий был придуман при необычных обстоятельствах — ночью, во время автомобильной поездки в горах Калифорнии. Автор этой идеи нобелевский лауреат Кэри Б. Мюллис так вспоминает момент озарения. «Иногда удачная идея приходит в голову совершенно неожиданно. Со мной, например, это случилось в одну из апрельских ночей в 1983 г., когда я, сидя за рулем автомобиля, пробирался по освещенной луной горной дороге в секвойные леса Северной Калифорнии. Мысль моя случайно натолкнулась на процесс, благодаря которому можно получать копии генов в неограниченных количествах. Теперь он называется «полимеразной цепной реакцией». За создание новой технологии ее автор получил Нобелевскую премию.

Полимеразная цепная реакция (сокращенно ПЦР) дает возможность в течение дня из одной молекулы ДНК получать 100 миллиардов идентичных по структуре молекул. Эта реакция довольно проста в исполнении: нужны лишь ДНК, пробирка, несколько реагентов и источник нагревания и охлаждения. Препарат ДНК, который необходимо копировать, может быть получен и из кусочка ткани, и из капли засохшей крови, и из засушенной мумии, и даже из тела мамонта, пролежавшего несколько тысяч лет в вечной мерзлоте. Суть этого метода изображена на рис. 14 на цветной вклейке.