Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2007 №11

Сенгеровский метод обрыва цепи дидезоксидными основаниями для секвенирования ДНК начинается с того, что посредством рестрикционных ферментов расщепляют подвергаемую секвенированию ДНК на меньшие участки, а ДНК нагревают до полного разделения обеих ее нитей. Затем к этим однонитевым участкам ДНК добавляют трифосфаты с дидезоксидным основанием, после чего вводится белковый фермент ДНК полимераза, который приступает к сборке копий исходной ДНК. Из-за дидезоксидных оснований собранные молекулы представляют собой не копии исходной ДНК, а смесь из полученных прежде участков ДНК. Предварительно дидезоксидные основания помечаются (маркируются) либо радиоактивным изотопом фосфора, либо чувствительным к ультрафиолетовому свету красителем, так что конец каждой оборванной цепи становится видимым.

Затем эту смесь цепей ДНК помещают в лунки пластины геля и дают электрическое напряжение. Более короткие участки испытывают меньшее сопротивление среды (обычно желе из водоросли агароза, схожее с желатином «Джелло»^[9] вещество, с той лишь разницей, что молекулы там образуют дополнительные связи, делая гель прочным) и поэтому движутся быстрее. Часто в качестве образца в одну из лунок помещают цепи известной длины. После достижения наиболее короткими цепями края пластины геля напряжение снимают. По радиоактивным или флуоресцентным маркерам определяют нуклеотидное основание в конце каждой молекулярной цепи. Поскольку электрофорез распределяет молекулы в соответствии с возрастанием длины цепи, при просмотре виден порядок расположения парных оснований нуклеотидов в исходной ДНК.

Данный метод широко применялся до середины 1980-х годов, и работа над диссертацией у многих аспирантов заканчивались участием в многолетнем проекте по секвенированию определенной части ДНК одного из модельных организмов. Приходилось брать пробы у организма, очищать, смешивать с химическими реактивами, выращивать, помещать в гель и проводить исследование, после чего собирать и толковать данные. Работа была тяжелой и продвигалась медленно. Обычно в ходе написания диссертации удавалось выстроить участок в 40 тыс. парных оснований ДНК.

Секвенирование генома человека

Озвучивая мнения многих влиятельных биологов, в номере Science за 7 марта 1986 года Ренато Дульбекко, глава Института биологических исследований им. Солка^[10], призвал к претворению в жизнь грандиозной программы по расшифровке генома человека. Он доказывал, что столь огромные усилия необходимы для понимания роли генов в развитии рака. Некоторые биологи, вроде Уолтера Гилберта (известного гипотезой РНК-мира), с радостью восприняли это предложение. Гилберт сказал: «Полный геном человека — Грааль генетики человека» (подробнее об этом сравнении далее).

Другие выразили озабоченность, что подобный гигантский проект исказит биологию до неузнаваемости. Расшифровка 3 млрд. пар азотистых оснований с помощью имеющихся на тот час средств потребует 15-летней непрерывной работы 10 тыс. аспирантов и обойдется примерно в 3 млрд. долларов. При таких затратах человеческих и денежных ресурсов ничего не останется на все остальные биологические проекты.

Луч надежды блеснул с появлением автоматизированных устройств секвенирования. Центр исследования человеческого генома [ныне Национальный институт генома человека], подразделение [сети институтов, объединенных общим названием] Национального института здоровья (НИЗ), официально приступил к работе в октябре 1990 года под руководством Джеймса Уотсона — да, самого Джеймса Уотсона. Данный проект задумывался как международный: большинство работ поручалось различным государственным лабораториям и университетам в США, и около трети приходилось на долю Великобритании, Франции, Германии и Японии.

Все усилия были сосредоточены на создании устройств автоматизированного секвенирования, что привело к наплыву в биологию приборостроителей. В конце 1986 года биохимик, доктор медицины Лерой Худ и биохимик-технолог Майкл Ханкапиллер создали компанию Applied Biosystems Inc. (ABI) и разработали устройство, способное секвенировать в день 12 тыс. парных оснований нуклеотидов. В начале 1987 года лаборатория молекулярной биологии, возглавляемая Дж. Крейгом Вентером, испытала секвенатор ABI 375А Sequencer вместе с рабочей станцией по катализу ABI 800 Catalyst для приготовления проб. Лаборатория Вентера занималась секвенированием двух участков, которые, как считалось, содержали гены, ответственные за крайне важные наследственные заболевания. Несмотря на отменную работу самих устройств, гены, поиском которых занимался Вентер, найдены не были. К тому же программное обеспечение выявило значительное число ошибочных результатов, так что многое пришлось сверять вручную.