Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №5

Как исследовать, действительно ли ген существует, то есть, транскрибируется ли данный участок ДНК? Для этого ген представляют в чипе частью его последовательности — олигонуклеотидом, который иммобилизован в микроплощадке с определенными координатами на этой матрице. Этот олигонуклеотид соответствует части экзона, предсказанного компьютером на основе сиквенса геномной ДНК. Чтобы выяснить, действительно геном в данном участке транскрибируется, берется клетка и из нее выделяется суммарная РНК. Из всех этих молекул РНК получают ДНК-копии, которые флуоресцентно метят и проводят гибридизацию с иммобилизованными на микрочипе олигонуклеотидами. Если в данных условиях какие-то площадки с олигонуклеотидами «молчат» (они показаны черным), то это значит, что участок геномной последовательности, комплементарной этому олигонуклеотиду, не транскрибируется. Если же площадка матрицы «светится», значит олигонуклеотиды в этой площадке прогибридизовались с флуоресцентно меченым продуктом, то есть соответствующий участок генома транскрибировался и действительно является частью какого-то гена.

Биологические микрочипы используются для одновременной детекции экспрессии многих генов

В реальном эксперименте все участки на матрице в той или иной мере «светятся». Поэтому без сравнения с некоторым стандартом, нельзя сказать, с чем связано появление сигнала в данной площадке чипа. Чтобы определить, является ли полученный результат ошибкой эксперимента или нет, проводится сравнение двух объектов. Для этого берутся некие клетки А, из них получают РНК, и их флуоресцентно метят (на слайде — красным). То же проводят и с клетками В, но метят РНК другим цветом (зеленым). Затем проводят гибридизацию чипа со смесью этих двух препаратов РНК. Если сигнал в данной площадке на чипе получается красным, значит в клетках А транскрипция данного гена сильнее, чем в клетках В. Если сигнал зеленый, то транскрипция сильнее в клетках В. Если красного и зеленого поровну, то получится желтый цвет. Таким образом, возникает возможность сравнивать уровень траснкрипции данного гена в разных клетках В, С, D и т. д., нормируя его на уровень транскрипции этого гена в клетках А. При этом сравнивают транскрипцию гена в разных тканях, в них гены экспрессируются по-разному. Можно сравнивать опухоль и норму, тогда выявляют те гены, которые специфически более сильно транскрибируются в опухоли или в норме. Можно посмотреть разные стадии развития, как работают гены в зародышевом развитии и во взрослом состоянии. Таким образом, гибридизация на микрочипах позволяет узнать, какие гены в геноме в данных условиях транскрибируются, а именно этим он и проявляет свою жизнь.

Биологические микрочипы могут быть использованы для установления относительного уровня экспрессии в клетках различных типов (например, печень — почки, норма — опухоль, зародыш — взрослый организм)

_{Если уровень экспрессии данного гена в образце А > В, цвет красный}

_{Если уровень экспрессии данного гена в образце А < В, цвет зеленый Если уровень экспрессии данного гена в образце А = В, цвет желтый}

_{Если образец А используется как нормирующий, то можно сравнивать экспрессию в образцах D, Е, F… друг с другом}

Гибридизация на микрочипах позволяет проверить компьютерное предсказание о том, что данный фрагмент генома — экзон, (участок, остающийся в зрелой мРНК) и он действительно транскрибируется. Каждый ген не обязан экспрессироваться во всех тканях и в каждых данных условиях. Поэтому нужно исследовать много условий и тканей, чтобы выявить все участки генома, соответствующие экзонам. На слайде каждая гибридизация на данном чипе соответствует какому-то одному типу ткани или условиям ее функционирования. Красным указано количество экзонов в каждой из хромосом, существование которых экспериментально подтверждено. На каждом чипе 1 090 408 площадок с пробами-олигонуклеотидами, соответствующими каждому из 442 785 экзонов человека, предсказанных компьютером.

Олигонуклеотиды в площадках соответствуют как транскрибируемой нити ДНК, так комплементарной нити. В геноме человека транскрипция комплементарных нитей ДНК, характерна для небольшой части генов. Такие гены перекрываются и, возможно, взаимно регулируются на уровне транскрипции. У бактерий перекрывание генов гораздо более частое явление, чем у эукариот.