В 1847 г. на страницах широкоизвестного немецкого ботанического журнала «Botanische Zeitung» он опубликовал статью, в которой весьма решительно высказался против воззрений Шлейдена на пол и способ образования зародыша у растений. Со стороны Гофмейстера это был довольно смелый шаг. Опровергнуть взгляды признанного авторитета, «властителя дум» многих ботаников — Шлейдена, отважился не ученый-специалист, а всего лишь скромный любитель растений, не имевший даже университетского образования. Начальное образование Гофмейстер получил в реальном училище, а его «университетом» был книжный и нотный магазин отца в Лейпциге, работать в котором он стал еще совсем юным. Интерес к природе и миру растений в нем возбудил отец, имевший небольшой ботанический сад и гербарий. К серьезным занятиям ботаникой его привело знакомство с знаменитым учебником Шлейдена «Основы научной ботаники», в котором содержался призыв к изучению мира растений на основе онтогенетического метода. Гофмейстер последовал этому призыву, и изучение истории развития растительных организмов сделал целью своей жизни.
Свой творческий путь Гофмейстер начал с эмбриологии растений. Он заинтересовался той острой полемикой, которая велась тогда вокруг вопроса оплодотворения и возникновения зародыша у растений. Острый критический ум и природная пытливость дали возможность начинающему ученому усомниться в правильности концепции Шлейдена на пол и образование зародыша у растений. Гофмейстер задумал собственными исследованиями выяснить вопрос о происхождении зародыша. Он ознакомился с трудами Амичи, Гуго фон Моля, Мейена и других, засел за микроскоп и провел серию наблюдений по изучению оплодотворения у ослинниковых. Гофмейстер подтвердил данные Амичи и нашел, что у ослинниковых, как у тыквы и орхидных, зародыш возникает из клетки зародышевого мешка — зародышевого пузырька — под влиянием оплодотворяющего действия пыльцевой трубки. Зародышевый пузырек при этом находится внутри зародышевого мешка еще до внедрения пыльцевой трубки. Таким образом, на примере ослинниковых Гофмейстер показал ложность представлений Шлейдена о возникновении зародыша из кончика пыльцевой трубки.
Несмотря на столь убедительные доказательства, поллинисты не хотели признать себя побежденными, и теория Шлейдена продолжала широко распространяться.
Проблема пола и образования зародыша у растений стала настолько актуальной в ботанике, что на нее обратили внимание некоторые научные общества и академии. Королевский Нидерландский институт в 1847 г. объявил конкурс на данную тему. Из представленных на конкурс рукописей, как это ни странно теперь, премией был увенчан труд Шахта, наиболее строгого последователя Шлейдена, содержащий ошибочные взгляды на сущность полового процесса у растений. В этой монографии, богато иллюстрированной и изданной в Амстердаме в 1850 г., Шахт с еще большей убежденностью, чем прежде, продолжал защищать неправильную точку зрения Горкеля и Шлейдена на возникновение зародыша из кончика пыльцевой трубки и возводил эту точку зрения в степень неопровержимой истины. Тем временем количество фактических доказательств, опровергающих это воззрение, быстро увеличивалось.
Взгляды Амичи и Гофмейстера относительно оплодотворяющей роли пыльцевой трубки разделил в 1849 г. известный французский ботаник Луи Тюлан, поддерживавший ранее идеи Шлейдена. Однако он по-прежнему не соглашался с мнением, что возникновение зародышевого пузырька предшествует вхождению пыльцевой трубки в зародышевый мешок.
За первой эмбриологической работой Гофмейстера быстро последовала вторая еще более обстоятельная, насыщенная обширным фактическим материалом. Исключительные способности, неистощимое трудолюбие, умение с помощью одной лишь обыкновенной бритвы приготовлять тончайшие микроскопические препараты позволили ученому за очень короткий срок — всего два года — изучить половой процесс у 38 видов растений, относящихся к 19 родам. В 1849 г. на основании полученного материала Гофмейстер опубликовал исследование «Происхождение зародыша явнобрачных растений», в котором полностью опроверг учение поллинистов и дал наиболее полное для своего времени представление об оплодотворении и, развитии зародыша у растений. Он описал развитие семяпочки и установил существование различных типов ее. Выяснил строение зародышевого мешка, проследил за образованием яйцевого аппарата и видел вторичное ядро зародышевого мешка. Гофмейстер обнаружил, что в зародышевом мешке на противоположных концах его к моменту оплодотворения имеются две группы клеток, каждая из которых состоит из трех клеток. Одна из трех клеток, расположенных в верхней части зародышевого мешка, является зародышевым пузырьком, т. е., на современном языке, яйцеклеткой. Из нее после оплодотворения, по мнению Гофмейстера, и развивается зародыш. Две другие клетки он назвал клетками-сестрами и отметил, что по мере развития зародыша они обычно исчезают.