История биологии с начала XX века до наших дней

В 1961 г. Н. Циндер и Т. Лёб открыли новый класс вирусов бактерий. Они выделили фаги f1 и f2, размножающиеся только в мужских штаммах бактерий (F⁺ и Hfr). Подобное ограничение обусловлено тем, что для адсорбции этих фагов необходимы F-пили, находящиеся только на поверхности мужских бактерий. Детали механизма проникновения фагов f1 и f2 не выяснены. Вскоре были открыты другие фаги, специфичные к мужским штаммам; многие из них напоминают f1 или f2. С фагом f1 оказались сходны фаги fd, М13 и F12, с фагом f2 — фаги MS2, fr и R27. Поэтому эти два семейства фагов условно обозначают символами f1 и f2.

Фаг f1 оказался мелким фагом, содержащим одноцепочечную ДНК, как и фаг ϕХ174. Но в отличие от последнего он содержит вдвое больше белка и имеет форму длинной изогнутой палочки. Механизм репликации ДНК фага f1 такой же, как у фага ϕХ174.

Фаг f1 отличается от всех вирусов бактерий способом его выделения из зараженной клетки-хозяина: секретирующие его клетки Е. coli продолжают расти и размножаться и никакого лизиса при этом не происходит. Так, спустя более 20 лет после того, как в опыте с одиночным циклом размножения фага было доказано высвобождение фагов только путем лизиса клетки, оказалось, что сторонники гипотезы «секреции» не так уж сильно ошибались.

Лёб и Циндер (1961) установили, что фаг f2 является мелкой сферической частицей, содержащей одноцепочечную РНК. Знание механизма репликации одноцепочечной молекулы ДНК фага ϕХ174 навело авторов на мысль, что в зараженных фагом f2 клетках РНК может находиться в двухцепочечной репликативной форме, что было установлено при помощи меченых атомов и седиментационного анализа. Авторы предложили следующую схему механизма репликации РНК фага f2. Одноцепочечная родительская цепь РНК, так называемая «плюс»-цепь, используется в качестве матрицы для синтеза комплементарной «минус»-цепи; в результате образуется двухцепочечная репликативная форма, «минус»-цепь которой служит матрицей для синтеза «плюс»-цепей РНК. До окончания синтеза первой дочерней «плюс»-цепи на репликативной форме начинается синтез второй, третьей, четвертой дочерних «плюс»-цепей. В итоге репликативная форма превращается в так называемый репликативный промежуточный продукт, состоящий из двухнитчатой РНК и нескольких однонитчатых РНК. На поздних этапах латентного периода содержание репликативной формы и репликативного промежуточного продукта достигает окончательного уровня, число частиц увеличивается, пока процесс репродукции не завершается лизисом клетки.

Общая схема внутриклеточного развития РНК-содержащего фага и его репликации (по Г. Стенту, 1971).

РФ — двухцепочечная репликативная форма, состоящая из «плюс»- и «минус»-цепей, синтезируется под действием фермента РНК-репликазы; РП — репликативный промежуточный продукт, состоящий из «минус»-цепи РНК и нескольких «плюс»-цепей, синтезирующихся друг за другом на матричной «минус»-цепи.

В экстрактах клеток Е. coli, зараженных фагом f2, был обнаружен фагоспецифичный фермент РНК-репликаза. Этот фермент оказался способным осуществлять синтез «плюс»- и «минус»-цепей фаговой РНК in vitro в реакционной смеси, содержащей фаговую РНК-матрицу и четыре рибонуклеозидтрифосфата (АТФ, ГТФ, УТФ и ЦТФ).

В 1965 г. И. Харуна и С. Спигельман очистили от нуклеаз ферментный комплекс РНК-репликазы, выделенный ими из экстрактов клеток Е. coli, зараженных фагом Qβ (этот фаг близок фагу f2), что позволило им наблюдать репликацию вирусной РНК in vitro. Вновь синтезированная РНК была не только идентична родительской РНК по физическим и химическим свойствам, но и обладала инфекционностью. Проникнув в клетку, она вызывала образование в ней интактных инфекционных частиц фага Qβ. Эти исследования позволили понять механизмы репликации РНК-содержащих вирусов растений и животных.