Дальнейшее изучение процесса закаливания растений показало, что во время морозов растения повреждаются и гибнут из-за накопления льда не в межклетниках, а в самой протоплазме, где он образуется при гораздо более низких температурах. Г.А. Самыгин (1960) выявил разные типы льдообразования в зависимости от скорости охлаждения. Повышению устойчивости растений к морозу способствует более короткий день, когда количество гормонов роста в растении резко снижается, а содержание ингибиторов роста, наоборот, возрастает, когда падает интенсивность обмена веществ и изменяется белковый состав. М.М. Окунцов и О.Ф. Аксенова (1960) обнаружили у озимой пшеницы глубокую перестройку дыхательных систем.
Новое объяснение природы морозоустойчивости растений дал Дж. Левитт (1962). По его мнению, определяющую роль в выработке устойчивости к низким температурам играют сульфгидрильные группы белков протоплазмы, тогда как дисульфидные группы тормозят этот процесс. При быстром оттаивании льда происходит заполнение водой межмицеллярного пространства, и ее гидростатическое давление вызывает разрыв образовавшейся между молекулами белка водородной связи, обладающей меньшей энергией по сравнению с дисульфидной. Концепция Левитта интересна как первая попытка объединить теорию механического повреждения кристаллами льда с биохимическим направлением в исследовании морозоустойчивости.
П.А. Генкель и Е.3. Окнина (1948, 1964 и позднее) развили представление об «обособлении» протоплазмы, согласно которому растение, готовящееся к перезимовке, впадает в состояние глубокого покоя; при этом плазмодесмы разобщаются и образующийся в межклетниках лед не может повредить протоплазму. Явление обособления протоплазмы было подтверждено многими исследователями как в нашей стране, так и за рубежом. На основании концепции обособления были предложены методы диагностики состояния покоя и морозоустойчивости плодовых растений, которые используются многими плодоводами-оригинаторами при выведении новых сортов.
Исследованиями П.А. Генкеля и Е.3. Окниной (1964), И.И. Туманова (1967) и других были выявлены три фазы покоя — органический, глубокий и вынужденный. Согласно взглядам Л.И. Сергеева (1960 и позднее), важной биологической характеристикой древесных пород является их годичный морфофизиологический ритм. В периоды наиболее интенсивного метаболизма устойчивость структуры их протоплазмы понижается, а при падении метаболизма, наоборот, повышается. При глубоком (органическом) покое происходит отток ряда соединений из листьев в зимующие органы, где идет синтез РНК, белков, липоидов и олигосахаридов. Одной из причин глубокого покоя является низкий уровень РНК и особенно ДНК на эмбриональной стадии почек.