Лессинг переносит действие в современную Италию, в которой, как и в Германии, царит деспотический произвол мелких князей. Принц Этторе Гонзага безраздельно властвует над своими подданными, он волен распоряжаться их честью, жизнью и состоянием в угоду своим прихотям. По складу характера князь Гвасталлы — вовсе не законченный злодей. Он наделен тонким умом, неплохо разбирается в искусстве, способен на возвышенные и страстные чувства. Однако он развращен лестью двора, безграничностью самовластия, не знает меры в стремлении к наслаждениям. Лессинг в своей трагедии обвиняет не отдельного человека, а всю феодально-абсолютистскую систему, уродующую и искажающую личность. Характер Этторе Гонзага более всего сформирован обстоятельствами, его положением в социальной иерархии.
Практика самодержавной власти подвергается в «Эмилии Галотти» всесторонней критике с позиций просветительства. Законы при дворе обращаются в свою противоположность, поскольку их применяют лишь исходя из выгод или минутных капризов монарха. Например, принц готов подписать смертный приговор неизвестному человеку, не вникая в суть дела, поскольку в это время он увлечен своими любовными переживаниями. Этторе Гонзага превращается в слепое орудие собственных страстей, чем ловко пользуется его фаворит Маринелли, коварный и расчетливый придворный. Именно его стараниями свершается кровавое преступление — убийство графа Аппиани, жениха юной и прекрасной Эмилии.
Лессинг выводит на сцену героев, пытающихся противостоять деспотизму княжеской власти и ее разлагающему влиянию. Полковник Одоардо Галотти и граф Аппиани презирают нравы двора, отстаивают свое право на человеческое достоинство. Отец Эмилии переживает подлинную трагедию. Робкой покорности и бесчестью он предпочитает гибель дочери, похищенной по приказу принца. Одоардо по просьбе Эмилии предает ее смерти и готов предстать перед божьим и человеческим судом как грозный обвинитель безнравственного и несправедливого князя. Но поднять руку на тирана он не решается. Формируя в демократически настроенных зрителях внутренний протест против старого мира, Лессинг обращается к их моральному сознанию, не призывая их к открытой борьбе.
«Эмилия Галотти» имела огромный и длительный успех на сцене и оказала значительное влияние на немецкую литературу. Лессинг создал удивительно стройную драматическую композицию, все элементы которой способствуют глубокому и целенаправленному воплощению авторской идеи. Великий просветитель стоял у истоков немецкой тираноборческой литературы последующих десятилетий. Под прямым влиянием его художественных и теоретических достижений молодой Шиллер создал первую немецкую политическую драму «Коварство и любовь».
Завершил трагедию Лессинг уже в Вольфенбюттеле, где он провел последние годы жизни (1770–1781), вынужденный после закрытия гамбургского театра снова искать пристанище. По приглашению брауншвейгского герцога Лессинг занял скромную должность ученого библиотекаря. Его творческие усилия в эти годы были обращены главным образом на изучение философии и религии. В 1774 1778 гг. он опубликовал отрывки из трактата немецкого философа-просветителя Реймаруса, критиковавшего священное писание с позиций «естественной религии», поддержав в своих примечаниях к «Фрагментам из сочинений неизвестного» критику легенды о воскресении Христа и Библии в целом. Однако, по мнению Лессинга, недостаточно выявить противоречия, содержащиеся в евангельских книгах. Следует рассмотреть историю возникновения и развития религии, связать ее с историей изменения человеческого разума.
Публикация Лессингом «Фрагментов», в особенности же — комментариев к ним, была воспринята церковью как попытка разрушить самые основы христианства и вызвала ожесточенные нападки на немецкого просветителя со стороны обскурантов, среди которых выделялся гамбургский пастор Геце. Лессинг отстаивал право мыслящего человека быть свободным в поисках истины. Острополемические памфлеты, объединенные под общим названием «Анти-Геце» (1778), содержали уничтожающую отповедь его главному преследователю.
Борьба Лессинга с официальной религией вызвала немедленную реакцию властей. Герцог запретил своему библиотекарю публиковать что-либо без предварительной цензуры. Однако Лессинг нашел способ продолжить опасный спор. В философско-историческом сочинении «Воспитание человеческого рода» (1777–1780) он изложил свои взгляды на эволюцию религии и морали. «Бог-воспитатель» проводит человечество через разные стадии религиозного сознания (язычество, иудаизм, христианство), которые соответствуют его «детству» и «юности». По мере приближения рода человеческого к зрелости нужда в «религии откровения» отпадает. Новая вера, новое моральное состояние человечества будут основываться на разуме и «естественной» добродетели, не нуждающейся в потустороннем поощрении.