Как подружить гены в клетках. Коктейль молодости, светящиеся котики, напечатанные органы и другие прелести науки

В основе стандартной методики CRISPR/Cas9 лежит разрезание ДНК: Cas-9 нуклеаза разрывает связи в обеих цепях ДНК. Далее она сшивает соседние нуклеотиды, беря информацию о нужной замене из соседней хромосомы или из последовательности, которую предоставляет экспериментатор. Такие заимствования могут быть опасными и смертельными для клетки. Существует метод замены оснований, при нем не происходит двуцепочечного разрыва, но варианты редактирования очень ограничены.

С этим под руководством Дэвида Лю решила разобраться группа ученых из Гарвардского университета, разработав метод прайми-рованного редактирования. В чем его суть?

Удлиненная гидовая РНК (ПргРНК) способна выполнять сразу две функции: определять конкретные участки ДНК, нуждающиеся в исправлении, и нести информацию об изменениях, которые нужно произвести.

Cas9 садится на ДНК, расплетает ее на две части. Второй фермент ПргРНК прилипает на противоположную нить и защищает ее. На рабочей нити Cas9 делает одноцепочечный разрыв, а ПргРНК вторым концом присоединяется к месту разрыва. К белку Cas9 подходит еще один фермент, и на основе присоединенной части ПргРНК строит новую последовательность, переписывая ген заново.

В итоге имеем две версии ДНК: старую и новую. Новую ферменты вшивают на место, а старая утилизируется. Но тут еще проблема: цепь с новой последовательностью не комплиментарна нерабочей, поэтому нужно провернуть еще раз такую операцию, но со второй цепью.

Успех такого редактирования составляет от 20 до 50 %, а частота ошибочных вставок около 10 %. У стандартного метода статистика хуже [23]. Но главное преимущество – универсальность метода: его можно применить и в случае потери последовательностей. В частности, удалось изменить гены при серповидноклеточной анемии и при болезни Тея-Сакса. Все же споры о широком применении такого метода еще не остановились и вызывают множество вопросов в ученых кругах.

А вот недавно исследователи смогли полностью удалить вирус иммунодефицита человека из организма мышей с человеческими Т-лимфоцитами с помощью препаратов и генного редактирования [24].

При ВИЧ вирусная частица поселяется в Т-лимфоците и не дает ему выполнять свою функцию – распознавать чужеродные агенты. Со временем организм вовсе перестает противостоять даже обычному ОРВИ. Лекарство, способное полностью удалить ВИЧ из организма, не существует: сегодня можно снизить его концентрацию в клетках человека до минимума и обеспечить полноценную жизнь на антиретровирусных препаратах.

Вирус не поражает клетки мышей, поэтому для начала ученые ввели им гемопоэтические клетки CD34+. После развития их в Т-лимфоциты специалисты ввели вирус. Через 14 дней мышам начали вводить антиретровирусные препараты LASER ART в наночастицах с липидной оболочкой, которая позволяет дольше поддерживать концентрацию препарата в крови. Были и другие группы: только с лечением препаратами и только с генной терапией, плюс контрольная группа безо всякого лечения. Во всех трех опытных группах концентрация вируса в крови снизилась, но лишь у группы с совместной терапией удалось полностью элиминировать вирус из организма. Хоть выборка мала и результаты применения методики далеки от 100 %-ного успеха, предпосылки обнадеживающие.

Для того чтобы определить влияние конкретного участка гена на проявления признака, необходимо либо внести в него мутацию, либо повлиять на активность этого гена. Можно изменить последовательность нуклеотидов при помощи системы CRISPR/Cas9. Однако эффективность не так высока, как хотелось бы. К тому же ген может быть настолько важен для организма, что необратимые изменения могут привести к серьезным последствиям для всего организма. А вот чтобы временно выключить фрагмент, можно использовать РНК-интерференцию (механизм уничтожения чужеродной двуцепочечной РНК). Она способна остановить работу гена на этапе транскрипции, влияя на матричную РНК (посредника между ДНК и новым белком). Но некоторые гены слишком активны, и такой способ также неэффективен.

Транскрипция – это перенос генетической информации с ДНК на РНК.

Есть белок Casl3a, который способен достаточно точно связываться с нужной молекулой РНК. Поэтому для новой системы взяли именно его [25]. CRISPR/Casl3 протестировали на клетках бактерий и растений. Чтобы эффективно использовать его у человека, ученые сделали так, чтобы белок синтезировался в эукариотических клетках, и добавили к нему последовательность, обеспечивающую доставку в ядро. После этого авторы проверили эффективность системы для снижения активности нескольких генов человека на фибробластах и клетках меланомы. Эффективность выключения составила от 30 до 85 %, что в среднем соответствовало эффективности контрольных проб для РНК-интерференции.