24 апреля 1500 года Леонардо прибыл в город своей юности, который не видел уже почти 20 лет. Тем временем ему исполнилось 48. Но он попытался еще раз связать свою жизнь с Флоренцией, некогда оставленной им. Последние десятилетия XV века полностью изменили город на реке Арно: господство Медичи было прервано, и в 1494 году на смену им пришел доминиканский монах Джироламо Савонарола, который добивался демократии с ярко выраженной теократической окраской и выступал за отмену обычаев, пришедших из глубины веков. Многочисленные сторонники культурного достояния прошлого, заклейменные им как «язычники», стали жертвами этого разрушительного процесса. Но конец его правления был также бесславен: отлучив от церкви и объявив вне закона, его приговорили к смертной казни, и 23 мая 1498 года он был сожжен на костре. Однако после его смерти в моде по-прежнему оставался новый пуританский образ жизни, который существенно отличался от стиля жизни при миланском герцогском дворе. Придворная роскошь, к которой так привык Леонардо, стала для него больше недоступной. Поскольку слава созданной им «Тайной вечери», хоть и медленно, докатилась и до Флоренции, его здесь принимали с почестями. В это время он получил заказ от монахов на изготовление картины для алтаря в церкви святого благовещения. Так Леонардо вместе со своим «хозяйством» поселился в обители нищенствующих монахов, которые с охотой пользовались материальными благами всего общества.
Заказчик у Леонардо вызвал удивление, и, как пишет Вазари, монах «вместо того чтобы начать, долго дышал» и когда наконец стал назойливо напирать на то, что они должны будут изготовить, и на то, что он, великий мастер, преспокойно занимается различными физическими экспериментами, усердно изучая вместе с Пачоли математику и геометрию, то Леонардо подумал, что сэкономленные им в дни пребывания при миланском дворе 600 дукатов позволяют ему отказаться от этого заказа. Но все-таки, если они такие же щедрые заказчики, как Изабелла, то он мог бы нарисовать портрет. В марте 1501 года брат Пиетро да Новеллара, посредник одной дамы, увлекавшейся искусством, сообщил своей патронессе об отрицательном ответе Леонардо: «По моему мнению, жизнь Леонардо протекает в быстро сменяющемся разнообразии и в целом неупорядоченно; складывается впечатление, что он живет одним днем и… своими математическими экспериментами, отчего забросил рисование красками настолько, что прикосновение к кисти у него должно вызывать отвращение».
Но если Леонардо и снизошел до работы над картиной, то только потому, что увидел в этом возможность провести некоторое время в обстановке спокойствия, о чем, естественно, не знали монахи. Прошло, по их меркам, много времени, прежде чем Леонардо, наконец, представил им рисунок, на котором, по сообщению Вазари, «изображалась „Богородица со святой Анной и младенцем Христом“ настолько прекрасно, что шедевр выдающегося мастера Леонардо поверг в удивление не только всех художников, но и всех тех, кто двумя днями раньше видел мужчину и женщину, пожилого и юного возраста, остановившихся в комнате паломников и направляющихся на блистательные праздничные торжества». Но у брата Пиетро да Новеллара было относительно увиденного им рисунка свое мнение. Он сообщил маркграфине в Мантую, что «младенец Христос вот-вот выскользнет из рук своей матери, после чего его схватит ягненок и, кажется, задушит». Речь в данном случае идет о знаменитой картине Леонардо «Святая Анна с Марией и младенцем Христом», которая хранится сегодня в национальной галерее Лондона. Написание ее продолжалось вплоть до 1507 года. Критики до сих пор удивляются единству трех фигур, свободе их движения и передаче нежных оттенков их лиц и заднего плана. Кроме того, картина привлекла внимание известных представителей психоанализа, о толкованиях которых мы поговорим далее.