Приближался конец беременности Марии. 19 июля в замке Эдинбурга у нее родился сын, который через 13 месяцев после того послужил поводом для шотландского дворянства свергнуть ее с престола и потом процарствовал 37 лет в Шотландии под именем Якова VI. После рождения наследника неприязнь между Марией Стюарт и ее мужем увеличилась. В то же время ее сердцем овладела гибельная страсть к графу Босуэлу. Этот дерзкий и опасный человек имел 30 лет от роду. Женившись на Анне Гордон, он сделался зятем графа Гэнтли, обладал большими поместьями и занимал важные государственные должности. Он задумал приобрести во что бы то ни стало любовь королевы и потом жениться на ней. Сначала Мария Стюарт искала в Босуэле полезного и преданного слугу, но скоро нашла в нем любовника и властелина. Благосклонность королевы к нему, быстро возраставшая, к концу лета 1566 года дошла до того, что бросалась в глаза всем. Босуэл господствовал при шотландском дворе и неограниченно управлял волею королевы. Приобретенная им власть и короткость, установившаяся между ним, Гэнтли, Атолем, Мерреем и Летингтоном, возбуждали сильные опасения в молодом короле Дарнлее. Но, видя ненависть жены, Дарнлей уехал в Стэрлинг. С этой поры королева впала в меланхолию, нередко повторяя: «Я хотела бы умереть». Долго не могли разгадать ее тайны. Наконец проницательный Летингтон разгадал ее тайну, сказав близким окружающим: «Сердце королевы разрывается при мысли, что король должен оставаться ее мужем и что она не видит никакого средства избавиться от него».
Между ее приближенными стали зарождаться гибельные замыслы об избавлении королевы от ненавистного мужа. Летингтон составил план столько же искусный, сколько и безнравственный. Этот план официально назывался «Дело о разводе королевы с мужем». О нем сообщили Босуэлу и другим придворным. Босуэл и королева охотно примкнули к нему. Но все знали, что испросить развод у папы нелегко, потому что для этого надо было сослаться на близость родства; не было также основания и начать с Дарнлеем процесс о нарушении супружеской верности или же обвинить его в измене. Мария видела эти затруднения. Но бесстыдный Летингтон попросил королеву предоставить это дело ему и ее друзьям. Организовалось тайное общество, члены которого подписали акт об убийстве короля как молодого сумасброда и тирана, врага дворянства и человека, державшего себя невыносимо по отношению к королеве. Бальфер, Гэнтли, Аджиль и Летингтон подписали его и сдали Босуэлу. Между тем состоялось крещение сына Марии Стюарт и Дарнлея. Королева Англии Елизавета, изъявив согласие быть восприемницей новорожденного, прислала вместо себя графиню Арджиль, а графу Бетворду поручила отвезти золотую купель. Хотя крещение было совершено по католическому обряду, но распоряжался им протестант Босуэл. Дарнлея даже не пригласили на церемонию.
Видя такое презрение к себе, а также с ужасом узнав о возвращении в отечество своих врагов Мортона, Рутвена и Линдсея и о полном прощении их королевой, Дарнлей немедленно уехал в Глазго к своему отцу графу Леноксу. Не успев приехать туда, он заболел оспой. Заговор против его жизни шел безостановочно. Босуэл приобретал все новых соучастников.
Спустя несколько недель после заболевания Дарнлея к нему в Глазго приехала сама королева. Это неожиданное посещение удивило выздоравливающего. Стороною он случайно узнал о заговоре против него. Но усыпленный видимой нежной привязанностью Марии, Дарнлей снова подпал под влияние королевы. В глубине сердца Дарнлей всегда страстно любил ее, и причиной его удаления от двора были столько же мучения ревности, сколько и оскорбленное самолюбие. Когда Мария стала упрекать его за боязливость и подозрительность, выказав при этом больше ласки, чем отвращения, Дарнлей обнаружил перед ней глубокое раскаяние, приписав свои ошибки молодости и неопытности, и обещал не впадать в них более. Он выразил ей, какое удовольствие он испытывает, видя ее около себя, и умолял не покидать его снова. Королева предложила ему переехать в Крэгмилар. Дарнлей обещал это, если она будет жить с ним в супружеском согласии. Она согласилась, но потребовала, чтобы он сохранил это примирение в тайне. После этого, нежно пожав его руку, она уехала.