Протеины отличаются от гидрокарбонатов и липидов тем, что включают в свой состав азот. По этой причине на азот как на необходимый компонент для живых организмов было обращено пристальное внимание. Французский химик Жан Батист Буссенго (1802 — 1887) начал в 1840-х годах изучать потребности растений в азоте. Он обнаружил, что у некоторых растений, например у овощей (горошка, бобов и прочих), имеется отличительная от других особенность успешно расти на безазотной почве, причем без удобрения азотом. Они не только росли, но и увеличивали содержание азота в своих тканях. Единственное заключение, к которому мог прийти Буссенго, — что эти растения потребляют азот прямо из воздуха. (Теперь нам известно, что не растения сами по себе делают это, но азотфиксирующие бактерии, поселяющиеся в клубеньках корней.)
Вместе с тем Буссенго пошел дальше, чтобы показать, что животные не могут получать азот из воздуха, а получают его с нищей.
Для этого он заострил практические и обоснованные выводы Мажанди, соотнеся содержание азота в некоторых продуктах со скоростью роста подопытных. Взаимосвязь оказалась прямой, при условии, что в качестве источника азота берется одна и та же пища. И все-таки некоторые виды питания были более эффективны, нежели другие, при аналогичном содержании азота. Это означало, что одни протеины более используются организмами, чем другие. Вплоть до конца века причины этого факта были неясны. Однако уже к 1844 г. сам Буссенго эмпирически смог составить шкалу полезности различных продуктов в качестве источника протеина.
Дальнейшую работу осуществил немецкий химик Юстус фон Либих (1805 — 1873), который за последующую декаду лет подготовил обоснованный список полезных продуктов питания. Либих сильно полагался на механистические взгляды, поэтому обосновывал проблему с точки зрения агрохимии. Он считал, что потеря урожайности культур в результате многолетнего использования земель происходит из-за разложения и потребления некоторых минеральных составляющих, необходимых растениям. Растительные ткани содержат небольшое количество натрия, калия, кальция, фосфора, а те, в свою очередь, поступают с растворимыми веществами, которые растения в состоянии поглотить. С незапамятных времен люди увеличивали плодородие почвы, возвращая ей израсходованное питание с пометом животных. Так отчего же не добавить в почву сами минералы, чистые химически и механически, не несущие неприятного запаха, вместо того чтобы вносить навоз?
Он первый начал эксперименты с химическими удобрениями. Поначалу, слишком полагаясь на выводы Буссенго о поглощении растениями азота воздуха, он потерпел неудачу. Когда Либих понял, что большинство растений получают азот от растворимых азотных компонентов почвы (нитратов), он добавил их в удобрения. Как Буссенго, так и Либиха можно считать основателями агрохимии.
Либих полагал, что гидрокарбонаты и липиды — горючие вещества организма, так же как они бывают горючими, будучи брошены в огонь. Это символизировало продвижение взглядов Лавуазье, выработанных полвека ранее. Лавуазье говорил об углероде и водороде, а сейчас можно было более специфично говорить о гидрокарбонатах и липидах — и те и другие состоят из углерода и водорода (плюс присоединенные радикалы кислорода).
Взгляды Либиха воодушевили других ученых на попытки определить, соответствует ли количество тепла, полученное от такого «топлива», аналогичному, если топливо будет сожжено вне тела, в окружающем пространстве. Со временем методики стали более тонкими, эксперимент усложнялся.
Устройства, которые позволяли бы измерить количество тепла, полученного от сожженных органических компонентов, были разработаны в 1860-х годах. Бертло использовал такое устройство (калориметр) для измерения тепла, произведенного сотнями реакций. В обычном калориметре горючее вещество смешивается с кислородом в закрытой камере и смесь взрывается электрическим взрывателем. Камера окружена водой. Вода поглощает тепло, полученное при взрыве, и в зависимости от повышения температуры воды можно определить количество выделившегося тепла.
Чтобы измерить тепло, производимое организмом, необходимо соорудить настолько большой калориметр, чтобы поместить туда этот организм. Исходя из расхода кислорода, потребляемого организмом, и выхода углекислого газа можно подсчитать количество сожженных гидрокарбонатов и липидов. Можно измерить количество тепла, производимого организмом, по повышению температуры водяного «кожуха». А это количество тепла уже возможно сравнить с тем, которое выделяется при обычном сжигании тех же количеств гидрокарбонатов и липидов в окружающей среде.
Немецкий физиолог Карл фон Войт (1831 — 1908), ученик Либиха, совместно с химиком Максом фон Петтенкофером (1818 — 1901) разработал подобный калориметр. Из сделанных ими измерений явствовало, что у живой ткани нет иного источника энергии, чем тот, что наполняет неживую природу.