Евреи горько разочаровались в своих надеждах. А между тем положение их стало ухудшаться и в Италии. Римские папы начали преследовать евреев в своих владениях и возобновили унизительные для них законы Иннокентия III. В городах евреев удаляли в особые кварталы (гетто), заставляли носить особый знак на одежде, не позволяли иметь больше одной синагоги в каждом городе. Гонения на Талмуд также возобновились. В то время Талмуд стал сильно распространяться, благодаря книгопечатанию (он был впервые напечатан целиком в 1520-х годах в Венеции). Враги евреев выступили со старым обвинением, будто в Талмуде содержатся обидные для христиан мнения. Римское духовное судилище (инквизиция) приказало сжечь книги Талмуда. В домах римских евреев произвели обыск и отобрали все найденные книги. В день Рош-гашаны (1553 г.) тысячи томов Талмуда были сожжены на костре в Риме. То же делалось и в других городах Италии. Позже католическое духовенство разрешило евреям вновь печатать Талмуд, но не иначе, как с исключением всех мест, противных христианской религии. Для этого были назначены особые цензоры, преимущественно из крещеных евреев, которые усердно зачеркивали в Талмуде все указанные места и не давали перепечатывать их.
Особенно враждебно относился к евреям фанатический папа Павел IV. В изданных им двух «буллах» он установил для евреев Рима и других городов Церковной области ряд унизительных ограничений в средневековом духе. По этим законам, евреи должны были жить в каждом городе в особом квартале, носить особую одежду для отличия от христиан. Христианам запрещалось жить у евреев в качестве домашних слуг, нянек и кормилиц, пировать или веселиться с ними, лечиться у еврейских врачей, даже называть еврея «господином». Обитателям гетто дозволялось вести только мелкую торговлю, преимущественно старым платьем, или заниматься ссудой денег под малые проценты; им запрещалось приобретать недвижимое имущество (буллы 1555 г.). Эти жестокие и оскорбительные законы довели евреев до крайней степени унижения и материального разорения.
Со второй половины XVI в., евреи в Риме и других городах Италии уравнялись в бесправии с германскими своими соплеменниками. Еврейский квартал, или гетто, в Риме находился на берегу Тибра, в низменности, которая во время разливов реки часто затоплялась водой. От других частей города гетто отделялось стеной, с воротами для входа и выхода. На ночь ворота запирались и охранялись особой стражей. По свидетельству одного путешественника, посетившего Рим в 1724 г., в еврейском квартале, состоявшем из двух больших и шести малых улиц, жило в крайней тесноте около 3000 семейств, т. е. 20–25 тысяч человек. Большинство их занималось мелкой торговлей и ремеслами. Улицы гетто были усеяны лавками и лавочками, где торговали всем, начиная со съестных припасов и кончая старым платьем. Торговля старьем особенно поощрялась римскими властями, как «привилегированное» занятие старого народа; старьевщики имели право обходить христианский город для закупки подержанных вещей и даже иметь склады своих товаров вне гетто. Из ремесел самым распространенным было портняжество. «Часто в летнее время, — рассказывает современник, — видишь сотни портных, сидящих за своей работой на улицах, возле дверей своих жилищ.
Женщины изготовляют тут же пуговицы и петли для пуговиц. Эти мастерицы так усовершенствовались в своем ремесле, что портные других народностей из всего города заказывают им изготовление пуговиц и петель. В общем три четверти евреев (ремесленников) суть портные, а прочие занимаются другими ремеслами».