Кризис аграрной цивилизации и генетически модифицированные организмы

ДНК-технологии позволяют исследовать и направленно изменять материал наследственности на разных уровнях его организации — генном, хромосомном, геномном, популяционно-генетическом. Интересно, что в смысле управления наследственностью «генетическую инженерию» использовали в течение тысячелетий безымянные селекционеры, благодаря которым еще в эпоху неолита и было введено в культуру абсолютное большинство возделываемых в настоящее время видов растений.

Переходя непосредственно к описанию методов генетической трансформации, отметим, что на сегодняшний день молекулярная генетика располагает значительным набором знаний и приемов для осуществления переноса генов из одних организмов в другие. Технология создания трансгенных растений включает большое количество этапов, среди которых можно выделить: получение целевых генов, создание векторов; трансформацию растительных клеток; подтверждение трансформации молекулярно-биологическими методами — обнаружение функционирующего целевого гена; регенерация целого растения из трансформированных клеток.

Подготовительный этап: конструирование вектора. На первом этапе конструирования рекомбинантной ДНК готовят вставки, пригодные для последующего соединения с вектором. В настоящее время наиболее часто используются 3 метода их получения: из фрагментов геномной ДНК; путем ферментативного или химического синтеза фрагментов ДНК; из сегментов ДНК, полученных с помощью ферментативного копирования РНК-матрицы in vitro.

В качестве вектора, которым может быть любой небольшой внехромосомный элемент (плазмида, ДНК фага или вируса), для трансформации растительных клеток обычно используют бактериальные плазмиды.

Следует отметить, что в большинстве случаев целевой ген подвергается модификации, поскольку, несмотря на универсальность генетического кода (он одинаков для всех организмов вне зависимости от уровня их организации), состав триплетов, кодирующих одни и те же аминокислоты у организмов, принадлежащих к разным видам, имеет некоторые отличия.

Замена кодонов никоим образом не сказывается на первичной структуре белка, в то время как экспрессия гена может быть усилена в сотни раз. Необходимый уровень экспрессии целевого гена в клетках растения достигается посредством использования соответствующих регуляторных элементов, контролирующих работу гена, — промоторов и терминаторов.

Следует отметить, что среди известных в настоящее время промоторов один из самых сильных — промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, поэтому в большинстве случаев именно его используют в качестве регулятора экспрессии целевого гена.

Таким образом, вносимая генетическая конструкция (вставка или кассета экспрессии) — это группа функционально связанных участков ДНК, состоящая из высокоактивного промотора, непосредственно за которым располагаются соответствующий целевой ген и терминатор транскрипции. После получения вектора и вставки начинается процесс конструирования рекомбинантной ДНК. Полученные молекулы ДНК вводят в бактериальные клетки для клонирования, что приводит к накоплению рекомбинантной ДНК. Эффективное увеличение количества ее копий возможно лишь при обеспечении оптимальных условий существования вектора, использующего метаболиты, ферменты и другие белки клетки-хозяина, а также ее аппарат белкового синтеза, поэтому основной инструмент молекулярного клонирования — совместимая комбинация хозяина и вектора. Наиболее широко применяются такие сочетания, когда в роли хозяина выступает штамм E.coli, а в роли вектора — его плазмида. Проникновение вектора в живые клетки E.coli проходит наиболее эффективно при условии повышенной проницаемости клеточных мембран, обусловленной, например, их локальным разрушением. Нарушение их целостности достигается либо воздействием электрического тока — электропорацией, либо посредством обработки клеток определенными химическими веществами, после чего перенос вектора происходит в течение нескольких минут. Векторы обычно содержат маркерные гены, благодаря которым осуществляется отбор клеток с измененным генотипом. Например, клетки, чувствительные к определенному антибиотику или токсину, можно использовать в комбинации с векторами, содержащими гены устойчивости к этим агентам. Выращивая микроорганизмы в условиях, при которых проявляется зависимость от маркерных генов, можно отобрать и размножить клетки, несущие требуемый генетический материал.

Методология прикладного использования ДНК-технологий