В 1793 году о. Серафиму исполнилось 34 года, и начальство, видя, что он по своим подвигам стал выше других братий и заслуживает преимущество пред многими, ходатайствовало о возведении его в сан иеромонаха. Так как в этом же году Саровская обитель, по новому расписанию, перешла из Владимирской епархии в Тамбовскую, то о. Серафима вызвали в Тамбов, и 2-го сентября епископ Феофил рукоположил его во иеромонаха. С получением высшей благодати священства о. Серафим стал подвизаться в духовной жизни с вящею ревностью и удвоенною любовью. В течении долгого времени он продолжал непрерывное служение, ежедневно приобщаясь с горячею любовью, верою и благоговением.
Сделавшись иеромонахом, о. Серафим возымел намерение совсем поселиться в пустыне, так как пустынническая жизнь была его призванием и назначением свыше. К тому же, от непрестанного келейного бдения, от постоянного стояния в церкви на ногах с небольшим отдыхом во время ночи, о. Серафим впал в недуг: у него распухли ноги, и на них открылись раны, так что некоторое время он лишился возможности священнодействовать. Болезнь эта была не малым побуждением к избранию пустыннической жизни, хотя для отдыха следовало ему просить у настоятеля о. Пахомия благословения удалиться в больничные келии, а не в пустыню, т.е. от меньших трудов - к большим и тягчайшим. Великий старец Пахомий благословил его. Это было последнее благословение, полученное о. Серафимом от мудрого, добродетельного и почтенного старца, в виду болезни его и приближения смерти. О. Серафим, хорошо помня, как во время его болезни ходил за ним о. Пахомий, теперь сам служил ему с самоотвержением. Раз о. Серафим заметил, что к болезни о. Пахомия присоединилась ещё какая-то душевная забота и печаль.
- О чём, отче святый, так печалишься ты? - спросил его о. Серафим.
- Я скорблю о сёстрах Дивеевской общины, - ответил старец Пахомий, - кто их будет назирать после меня?
О. Серафим, желая успокоить старца в предсмертные минуты, обещался сам назирать их и поддерживать всё так же после смерти его, как было при нём. Это обещание успокоило и обрадовало отходящего ко Господу о. Пахомия. Он поцеловал о. Серафима и затем вскоре опочил мирным сном праведника. О. Серафим горько оплакал потерю старца Пахомия и, с благословения нового настоятеля о. Исаии, также горячо любимого, удалился в пустынную келию (20-го ноября 1794-го года, в день прихода в Саровскую пустынь).
Несмотря на удаление о. Серафима в пустынку, народ стал беспокоить его там. Приходили и женщины.
Великий подвижник, начиная строгую пустынническую жизнь, считал для себя неудобным посещение женского пола, так как это могло соблазнить и монашествующих, и мирян, склонных к осуждению. Но, с другой стороны, лишить женщин назидания, ради которого они приходили к пустыннику, могло быть делом, неугодным Богу. Он стал просить Господа и Пресвятую Богородицу об исполнении его желания, и чтобы Всевышний, если это не противно Его воле, дал ему знамение на то преклонением ветвей вблизи стоявших дерев. В преданиях, записанных в своё время, есть сказание, что Господь Бог действительно дал ему знамение Своего изволения. Наступил праздник Рождества Христова; о. Серафим пришёл в монастырь к поздней обедне в храм Живоносного Источника и причастился Св. Христовых Таин. После обеда в своей монастырской келии он вернулся на ночь в пустыню. На следующий день, 26-го декабря, празднуемый по положению (Собор Пресвятой Богородицы), о. Серафим вернулся ночью в обитель. Проходя свой холм, где он опускается вниз долу, отчего гора и названа была о. Серафимом Афонскою, он увидел, что с обеих сторон тропинки огромные сучья вековых сосен склонились и завалили дорожку; вечером ничего этого не было. О. Серафим упал на колени и поблагодарил Бога за данное, по молитве его, знамение. Теперь он знал, что Господу Богу угодно, дабы жёны не входили на его гору.