Лысенко был прав!

Каталитической частью РИСКа являются белки-эндонуклеазы семейства Аргонавт (Argonaute), которые разрезают мРНК. Фрагменты, которые образуются после разрезания белком Дайсером, являются двухцепочечными. Потенциально каждая из цепочек может являться малой интерферирующей РНК. Однако, лишь одна из двух цепочек, называемая ведущей цепочкой, связывается с белком Аrgonaute и вызывает сайленсинг гена.

Другая цепочка, называемая цепочкой-спутницей, подвергается деградации.

У эукариот белки Аргонавты обнаружены в высоких концентрациях в районах цитоплазмы клеток, известных как Р-тельца, цитоплазматические тельца, в которых разрушаются мРНК Семейство белков Аргонавт очень древнее. Эти белки есть не только у эукариот, но и у некоторых архей и даже бактерий, что свидетельствует о том, что проблема удаления двойных цепей РНК существовала с незапамятных времен (217)

II.21. ГИБРИДИЗАЦИЯ IN SITU

Свойство нуклеиновых кислот образовывать склейки (интерферировать или подвергаться межмолекулярной гибридизации) если последовательности нуклеотидов комплементарны друг другу было использовано в науке одним из первых.

В цитологии, гистологии и патологической анатомии широко применяется так метод так называемой гибридизации ин ситу (in situ). Суть его в том, что если исследователь знает последовательность нуклеотидов в каком-то участке гена, то можно определить положение данного гена в пределах хромосомы. Кроме того путем измерения количества мРНК, синтезированной на основе информации, которая записана в данном гене, можно количественно выявить, на каких генах происходит процесс транскрипции (синтеза молекул РНК на базе комплементарной ДНК) в данной клетке (75).

Гибридизации нуклеиновых кислот используется для мечения ДНК и РНК с помощью видимых в микроскопе маркеров. При этом гибридизация используется для мечения особых последовательностей ДНК и РНК. Если РНК являясь одноцепотчатой доступна для мечения сразу, то для того, чтобы сделать ДНК доступной для гибридизации и мечения надо ее нагреть, чтобы двойная цепь ДНК разошлась на одиночные цепочки.

Для этого ученые синтезируют короткие цепочки ДНК или РНК, комплементарные гену или его мРНК. Затем берутся образцы тканей или органов и готовятся гистологические или электронно-микроскопические срезы. Затем срезы нагреваются.

При этом цепи ДНК из-за резкого увеличения подвижности молекул разрывают водородные связи и расплетаются, превращаясь в одиночные. Они становятся доступными для склеивания с короткими одиночными цепями ДНК, добавляемых к срезу извне. Если срез охладить после добавления, то короткие цепи конкурируют с комплементарными цепями ДНК за места склеивания и гораздо успешнее, чем длинные молекулы, приклеиваются (интерферируют или подвергаются гибридизации) к комплементарным участкам расплетенной молекулы ДНК. Короткие цепи имеют тенденцию приклеиваться к комплементарным участкам. Если участки менее комплементарны, чем длинная комплементарная нить ДНК, то короткие цепи хуже склеиваются и проигрывают соревнование за места склеивания.

Метод осуществляется таким образом — сначала срезы нагревают до температуры плавления ДНК (это температура, при которой происходит отклеивание двух нитей ДНК друг от друга, обычно около 90 °C), затем при чуть более низкой температуре добавляют наш зонд в виде короткой одиночной цепи ДНК, которая мечена либо с помощью внедрения в молекулу радиоактивного изотопа либо путем химического пришивания к цепи нуклеотидов вещества, которое испускает под воздействием света с короткой длиной волны фотоны света с более длинной волной (возникает так называемая флюоресценция). Измеряя радиоактивность в экспериментальных и контрольных образцах, подготовленных абсолютно одинаково, можно судить количественно о том, какие гены есть в данных клетках. Если вместо короткой нити ДНК использовать короткую комлементарную и меченную нить РНК, то можно измерить уровень транскрипции с данного гена.

Введение метода ДНК-ДНК гибридизации позволило доказать, что микоплазмы (самые примитивные бактерии) являются самостоятельной группой, получившей название класс Mollicutes (216).

II.22. ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ РНК

Не надо забывать, что у живых организмов идёт постоянный обмен веществ. Поэтому надо знать не только механизм синтеза молекул, но и механизмы их последующей обработки (химической модификации и упаковки в трехмерном пространстве и разрушения), иначе, если будет излишек синтеза, но не будет разрушения, то будет избыток данной молекулы. Двойные спирали РНК существуют в виде рРНК, сРНК, тРНК. Поэтому в клетке должны быть механизмы для их разрушения, так как идёт постоянный обмен веществ и клетка должна постоянно приспосабливаться к изменениям внешней среды.