Но партия Гизов и их сторонников из числа непримиримых католиков желала продолжения гражданской войны, вспышки которой были вновь зафиксированы в 1567 и 1568 годах. Екатерина делала все возможное, чтобы достичь примирения. Она вела переговоры с Гизами, а однажды даже пригласила на встречу с королем воинственного адмирала де Колиньи. Случилось так, что, когда тот приехал в Париж, Екатерина навещала свою заболевшую дочь Клод, герцогиню Лотарингскую. При встрече с бесхитростным, восприимчивым юным венценосцем адмирал пустил в ход все свое обаяние, и они засиделись за разговором в королевских апартаментах Лувра чуть не до рассвета. Выяснилось, что де Колиньи пытался обернуть влияние Екатерины на короля себе на пользу; узнав об этом, та пришла в ярость, поспешно вернулась в столицу и быстро поставила на место своего слабовольного сына.
В стремлении примирить две партии Екатерина обвенчала свою дочь Маргариту с молодым лидером протестантов Генрихом Наваррским из королевского рода Бурбонов. В августе 1572 года вожди католиков и протестантов собрались в Париже на бракосочетание. Народ ликовал, колокола Нотр-Дама и других церквей звонили вовсю, но атмосфера в задыхающемся от зноя городе оставалась неспокойной. Папа дал знать, что он против этого брака — союза между католиками и протестантами быть не может. Поэтому церемония была проведена не в самом Нотр-Даме, но на прилегающей к нему площади. В кульминационный момент, когда служили литургию, протестанты поднялись и якобы «вышли прогуляться».
Через четыре дня, в среду 20 августа, когда еще продолжались народные гуляния, на адмирала де Колиньи было совершено покушение. По нему стреляли из аркебузы из окна на втором этаже, когда он прогуливался по улице Бетизи (ныне улица Риволи). Но в момент выстрела де Колиньи наклонился завязать шнурок на ботинке и был только ранен. Дом, из которого стреляли, принадлежал, как выяснилось, одному из членов семьи Гизов; ясно, что они жаждали отомстить за смерть Франсуа.
Екатерина и Карл поспешили навестить Колиньи. Адмирал попросил оставить его с королем наедине.
На обратном пути в Лувр Екатерина угрозами заставила сына рассказать, о чем шла речь, — судя по всему, де Колиньи убеждал молодого короля не доверять матери. Париж был охвачен волнениями: двести гугенотов захватили дом Гизов на улице Бетизи, а вооруженные группы их единоверцев кружили по городу. Рынки и лавки закрылись — горожане искали убежища у себя дома.
Требовались срочные действия, иначе ситуация в столице могла выйти из-под контроля, и от этой искры в стране вполне мог разгореться костер новой гражданской войны. На следующий день Карлу IX были предоставлены доказательства того, что де Колиньи действительно что-то замышляет против него, и, узнав об измене нового друга, король, говорят, полностью утратил самообладание. Действовал ли он далее по собственной инициативе или по подсказке матери — неясно, но в воскресенье 24 августа, на рассвете Дня святого Варфоломея, королевские гвардейцы во главе с одним из представителей партии Гизов ворвались в дом де Колиньи и, забив его до смерти, вышвырнули тело на улицу. Это был сигнал к началу резни. Гугенотов — мужчин, женщин, детей — хватали прямо в постелях, вытаскивали на улицу и убивали. Оргия длилась два дня, на протяжении которых было убито две с половиной тысячи человек. О Варфоломеевской ночи стало известно по всей стране, и нечто подобное повторилось в Орлеане, Руане, Лионе, Бордо и Тулузе; общее число жертв достигло восьми тысяч. Так было положено начало религиозным войнам, которые опустошали Францию в течение ближайших тридцати лет.
Представляется весьма вероятным, что Екатерина де Медичи принимала по крайней мере некоторое участие в организации Варфоломеевской ночи. То ли она утратила обычное самообладание, то ли иного выхода не видела, сказать трудно, хотя можно не сомневаться, что, не нанеси она удара первой, и ее жизнь, и жизнь короля были бы в серьезной опасности. В любом случае Екатерина де Медичи повинна в этой кровавой мясорубке, одной из самых страшных в европейской истории. Отныне ее стали считать лидером католической Франции в ее борьбе с гугенотами.
Свидетельства о том, насколько эти события оказали воздействие на Екатерину де Медичи лично, расходятся. Иные утверждают, что она от них так и не оправилась. После пятидесяти в ее властном характере стал все больше и больше проступать цинизм, а плотная фигура пожилой женщины стала рыхлой и отталкивающе тучной. Другие утверждают, что она по-прежнему сохраняла живость, охотилась, танцевала, была, как и ранее, остроумна в разговоре. Франция оказалась непримиримо расколота на две части — даже в оценке своей королевы.