Вскоре после похода Васко Нуньеса де Бальбоа до испанцев дошли слухи о расположенной дальше к югу богатой стране Биру (Перу). Речь шла об огромной державе инков Тауантинсуйю. Покорить ее решил незаконный отпрыск дворянского рода Франсиско Писарро. Его отряд из 168 солдат вступил в пределы державы инков в 1532 г., вскоре после того как там завершилась борьба за власть между двумя претендентами. Сторонники проигравшего в этой борьбе Уаскара обратились за помощью к испанцам, снабдив их необходимой информацией о положении в стране. Испанцы захватили в плен правителя (верховного инку) Атауальпу. Тот предложил им огромный выкуп золотом, но, когда большая часть сокровищ была уже собрана, испанцы под надуманным предлогом казнили Атауальпу и объявили верховным инкой его племянника, ставшего орудием в их руках. Заняв в 1533 г. столицу инков город Куско, испанцы утвердились в центральной части Перу. Вскоре они покорили территории нынешнего Эквадора и южной части Колумбии, а в 1535–1537 гг. отряд во главе с Диего де Альмагро проложил дорогу в Боливию и северную часть Чили. Позже испанцы не раз пытались завоевать центральные и южные районы Чили, но за три века колониального господства так и не сумели покорить жившие там племена арауканов.
С завоеванием Перу связано еще одно важное открытие. В 1541–1542 гг. Ф. де Орельяна, перейдя в составе экспедиции Г. Писарро через Анды, на кораблях спустился по течению реки Амазонки почти от истоков и до устья.
Увидев в пути индейских женщин, сражавшихся бок о бок с мужчинами, испанцы решили, что достигли описанного древними авторами царства амазонок. Так возникло название Амазонка, а европейцы получили представление об огромных размерах Америки.
В горную Колумбию, где жили племена чибча-муисков, испанцев привели слухи о стране позолоченного вождя — Эльдорадо. В 1536–1537 гг. испанцы устремились туда почти одновременно с трех сторон. Один из отрядов шел с юга, из Перу, другой был снаряжен агентами немецкой торговой компании Вельзеров, которая в конце 20-х годов купила у Карла V право на колонизацию части земель к югу от Карибского моря. Отряд под руководством Г. Хименеса де Кесада немного опередил конкурентов и подчинил себе страну, захватив немалые богатства. Однако легенда об Эльдорадо как символе богатства Америки оказалась столь привлекательной, что и после этого испанцы, а затем и представители других стран еще долго продолжали искать по всей Америке «Золотую страну», и лишь десятилетия неудач поубавили их пыл.
В 30-е годы еще один поток испанской колонизации устремился в глубь континента со стороны залива Ла Плата; рядом с ним в 1536 г. был основан город Буэнос-Айрес. Вскоре два потока — с северо-запада, т. е. из Перу, и с юго-востока, от залива Ла Плата — сомкнулись. Историческое значение имело открытие на территории нынешней Боливии «серебряной горы» Потоси (1545), во многом предопределившее судьбу Америки.