Первым потрясением стали результаты экспериментальных исследований немецкого физиолога Э. Пфлюгера, выполненных им в 1872–1875 гг. и неопровержимо доказавших ошибочность сразу двух ключевых положений прежней системы представлений.
Во-первых, прижизненное разрушение органических веществ (углеводов, жиров, белков), обеспечивающее организму необходимую для жизни энергию, происходит не в результате прямого воздействия кислорода на эти вещества, т. е. не является прямым окислением или «медленным горением» (лягушки, помещенные Э. Пфлюгером в атмосферу чистого азота, могли существовать около 20 часов и выделяли при этом значительное количество углекислого газа). Во-вторых, местом протекания этих процессов является не кровь, а клетки, и разрушению подвергаются не поступающие в кровь органические вещества пищи, а собственное «живое вещество» клеток (лягушки, сосудистая система которых была тщательно промыта от крови и наполнена физиологическим раствором («солевые лягушки»), долгое время продолжали выделять нормальное количество углекислого газа).
Экспериментальные исследования Э. Пфлюгера заставили полностью переосмыслить весь накопленный к тому времени фактический материал, касавшийся изучения проблем жизнедеятельности. Ключевую роль в решении этой задачи сыграл крупнейший физиолог XIX столетия К. Бернар. В серии публикаций 1875–1878 гг. он высказал и обосновал принципиально новый взгляд на фундаментальные основы жизнедеятельности — «жизнь есть результат столкновения между внешним миром и организмом», состоящий из двух разнонаправленных процессов — разрушения (распада органических веществ клетки) и созидания (органического синтеза), протекающих в строго определенных физико-химических условиях.
К. Бернар полагал, что процесс распада органических веществ, обеспечивающий выделение энергии, протекает в протоплазме клеток и вызывается особыми белками самого организма — ферментами. «Органическое созидание» состоит в восстановлении «разрушенных во время активной жизнедеятельности элементов тела» и, согласно высказанной им гипотезе, является результатом физиологической активности клеточных ядер, в которых синтезируются органические вещества, поступающие затем в протоплазму клетки для того, чтобы «вновь оказаться разрушенными».
Оба процесса были признаны им универсальными для всех форм живых существ, а возможность их осуществления поставлена в прямую зависимость от физико-химических условий среды, в которой находятся клетки. Применительно к организму человека роль такой среды К. Бернар отвел крови, лимфе и межтканевой жидкости, назвав их внутренней средой организма, а сохранение оптимальных для клеток физико-химических показателей этой среды — важнейшим условием «свободной жизни» и основной задачей всех без исключения систем органов.
Подобно А. Лавуазье, Э. Пфлюгер и К. Бернар обозначили программу научных исследований в области изучения фундаментальных основ жизнедеятельности на много лет вперед. Практическая реализация этой программы привела к множеству судьбоносных открытий, часть из которых была совершена уже в последней четверти XIX столетия.
Ряд крупных научных прорывов был совершен и в области изучения механизмов регуляции и поддержания постоянства физико-химических показателей внутренней среды организма.
Во-первых, в 1893–1898 гг. английский физиолог Дж. Ленгли открыл и детально описал принцип устройства и механизмы функционирования так называемой автономной (вегетативной) нервной системы. Дж. Ленгли выделил в ее составе два отдела (симпатический и парасимпатический), доказал их функциональный антагонизм и возможность самостоятельно осуществлять процессы регуляции физиологической активности подавляющего большинства внутренних органов и систем.
Во-вторых, экспериментальные исследования Н.И. Лунина (1881), Т. Кохера (1883), Д. Муррея (1891); Э. Шеффера (1894), Й. фон Меринга (1889), Ш. Броун-Секара (1889); И.П. Павлова (1897) показали существование принципиальной возможности не только нервной, но и гуморальной регуляции деятельности внутренних органов и показателей внутренней среды. На основании этих исследований была высказана гипотеза о существовании особых химических веществ, обладающих выраженной физиологической активностью, полностью подтвердившаяся уже в начале XX в. после открытия гормонов и витаминов.
Чрезвычайную эффективность механизмов нейрогуморальной регуляции наглядно продемонстрировали экспериментальные исследования физиологии пищеварительной системы, выполненные научной группой под руководством российского физиолога И.П. Павлова. И.П. Павлов и его сотрудники установили основные закономерности функционирования главных пищеварительных желёз (слюнных, желудочных, дуоденальных, поджелудочной железы, печени), раскрыли механизмы их регуляции и впервые сформировали целостное представление о деятельности пищеварительного тракта как единой физиологической системе (1897).