Неандерталец. В поисках исчезнувших геномов

Итак, ДНК в мумиях есть, и следующий шаг очевиден – нужно клонировать ее в бактериях. Я обработал кусочки ДНК ферментами, которые увеличивают восприимчивость свободных концов нитей, смешал с бактериальными плазмидами, затем добавил ферменты, которые сшивают вместе концы ДНК. Если все сделано правильно, то получается гибридная молекула, в которой соединены ДНК мумии и бактериальной плазмиды. Когда такую плазмиду внедряют в бактерию, то вся плазмидная ДНК реплицируется, давая множество копий, в том числе и встроенных участков. Но более того, если в плазмиде присутствует ген устойчивости к антибиотику, то я могу, добавив в среду этот антибиотик, отобрать бактерий с успешно внедренными плазмидами. Если на среде с антибиотиком вырастут колонии бактерий, то это будет означать, что операция по добавлению чужеродного фрагмента к бактериальной последовательности прошла успешно. Каждая такая колония берет начало от бактериальной клетки, несущей кусочек ДНК из мумии. Результат нужно было проверить – и я проделал контрольные эксперименты, это наиважнейший элемент любой лабораторной работы. Я сделал все то же самое, но не добавил к плазмидам ДНК мумии, а в другом контрольном варианте добавил к плазмидам современную человеческую ДНК. Когда бактерии вобрали в себя раствор с плазмидами, я высадил их на агар (это обычная микробиологическая питательная среда) с антибиотиком и отправил на ночь в инкубатор с температурой 37 оС. Наутро я открыл дверцу инкубатора и в предвкушении вдохнул густой влажный запах питательной среды. На чашке с современной ДНК выросли тысячи колоний, они покрывали почти всю поверхность. Это значит, что плазмиды сработали – бактерии выжили, потому что захватили плазмиды внутрь клеток и стали их реплицировать. Чашка, где к плазмидам не было добавлено никаких ДНК, оказалась безжизненной – колоний на ней не было. Отсюда можно заключить, что в моем эксперименте не было никаких дополнительных источников ДНК. А в самой главной чашке, той, куда добавлены были ДНК берлинской мумии, выросло около сотни колоний. Я был совершенно счастлив – я со всей очевидностью реплицировал ДНК 2400– летней мумии! Но только вдруг это ДНК бактерий из образца мумии, а не из самой мумии? Как доказать, что хотя бы часть этой ДНК принадлежит человеку?

Мне нужно было так или иначе определить последовательность этой ДНК, показав, что она человеческая, а не бактериальная. Если я возьму случайный клон, то может попасться и человеческий, и бактериальный фрагмент, а я потрачу на определение его последовательности, секвенирование, огромный труд; ведь тогда, в 1984 году, человеческий геном за исключением небольших участков еще не расшифровали, не говоря уже о сотнях геномов микроорганизмов.

Поэтому меня не воодушевляла идея секвенировать случайный клон, нужно было выбрать строго определенный. Тут очень пригодилась методика, позволяющая идентифицировать клон, в котором присутствует последовательность нуклеотидов, похожая на некую заранее известную. Нужно взять некоторое количество бактерий из каждой колонии, поместить их на особый бумажный фильтр, где бактерии будут разрушены и их ДНК свяжется с веществом фильтра. Затем можно взять раствор с кусочками одноцепочечных ДНК, в которых присутствуют радиоактивные изотопы; эти “пробные” цепочки представляют ту последовательность, которую нужно выявить. Они будут гибридизоваться с комплементарными 411–417 (1985). цепочками ДНК, присутствующими на фильтре. Я выбрал участок ДНК с характерным элементом человеческого генома – повтором Alu. Эта последовательность примерно из трехсот нуклеотидов встречается в геноме человека почти миллион раз, еще она имеется у обезьян. Этот повтор настолько распространен в человеческом геноме, что составляет более 10 процентов от его объема. Если бы такой повтор нашелся в бактериальных клонах, то это бы означало, что хотя бы в некоторых из них содержится ДНК человеческой природы.

Я взял кусочек гена, с которым занимался в лаборатории – там, как я знал, имелся повтор Alu, – внедрил в него радиоактивную метку. А потом обработал фильтр с теми самыми клонами. Некоторые из них гибридизовались с радиоактивной цепочкой – что и следовало ожидать от ДНК с человеческими свойствами. Я выбрал клон с самыми явными признаками гибридизации. Он содержал фрагмент ДНК, состоящий из примерно 3400 нуклеотидов. Взяв в помощники Дана Лархаммара, дипломника, который слыл у нас специалистом по секвенированию ДНК, я определил часть последовательности ДНК клона. И там действительно нашелся элемент Alu . Я очень обрадовался. В моих клонах присутствовала человеческая ДНК, она была получена именно с помощью бактериального клонирования.