Неандерталец. В поисках исчезнувших геномов

Определение подобных ошибок — задача не новая, и у нас уже были кое-какие наработки. Вот, например, Михаэль Хофрайтер, дипломник из моей лаборатории, в 2001 году вместе с другими коллегами показал, что самый распространенный дефект древних ДНК — потеря аминогруппы в цитозинах. Это получается неизбежно само собой, если в материале присутствует хоть капелька воды. Теряя аминогруппу, цитозин превращается в урацил, обычный нуклеотид РНК. ДНК-полимераза считает его тимином. Так вот, нужно сравнить число тиминов в мамонтовой или медвежьей ДНК с современной слоновьей или собачьей, в особенности в тех местах, где подозреваются цитозины. И мы увидим резкое преобладание тиминов. Так оно и вышло, но, к нашему удивлению, еще обнаружилось некоторое превышение гуанинов по сравнению с аденинами. Это означало, что древний аденин, как и цитозин, может по ходу дела потерять свою аминогруппу. Мы, конечно, проверили это предположение: синтезировали ДНК с цитозинами и аденинами, лишенными своих аминогрупп, и потом посмотрели, как с такой последовательностью справится ДНК-полимераза. ДНК-полимеразу взяли ту же, которую использовала 454 для пиросеквенирования. И в результате ДНК-полимераза прочитывала Ц как Т, но и вместо А она читала Г. Мы написали об этом статью^[47] и опубликовали ее в PNAS в сентябре 2006 года: не только цитозины могут терять аминогруппы, но и аденины — вот как. Однако довольно скоро мы обнаружили, что ошиблись.

Между тем в отношениях с группой Эдди Рубина в Беркли наметилась некоторая напряженность. Нам в Лейпциге уже стало ясно, что пиросеквенирование по крайней мере в десять раз эффективнее, чем бактериальное клонирование. Еще раньше у нас создалось впечатление, что в процессе клонирования большое количество ДНК теряется и происходит это, когда бактерию “вынуждают” присоединить к себе чужую ДНК. Но Эдди спорил, что низкая эффективность опытов с пещерными медведями не более чем случайное стечение обстоятельств. Он, как всегда, был полон энтузиазма во время регулярных телефонных конференций между нашими группами. Я разрывался. С одной стороны, после многолетнего топтания на месте мы не только сможем прочитать неандертальский геном, но даже сделать это несколькими способами. А с другой — мы скорее примем на вооружение методики, требующие граммов исходного материала, а не килограммов, как у Эдди. Пиросеквенирование 454 отвечало всем требованиям эксперимента, но Эдди в конце концов убедил меня еще раз попробовать клонирование. И я решил параллельно провести два эксперимента по двум разным методикам на материале — да-да — реальной неандертальской ДНК.

Мы приготовили два экстракта из неандертальской кости самой лучшей сохранности, из образца, известного как Vi-80. Из него в 2004 году Давид Серр секвенировал высокополиморфную часть мтДНК. В середине октября 2005-го мы отправили вытяжки в 454 Майклу Эгхольму для прямого секвенирования и в лабораторию Эдди Рубина для клонирования в бактериях и последующего секвенирования. Вытяжки готовил Йоханнес Краузе в нашей “чистой комнате”. Мы все очень волновались, не занесут ли инородные ДНК в наши “чистые” экстракты при работе в “чужих” лабораториях в Калифорнии и Коннектикуте. Ведь предстоящие эксперименты должны показать, какая из методик лучше, и ее-то мы и развернем в наших “чистых” помещениях.