Первые серийные Ан-2 поступили в распоряжение Министерства геологии СССР. Одновременно ими оснащались летные отряды ГВФ. С июня 1950-го самолет начал поступать в МВД и пограничные войска, с июня следующего года — в ДОСААФ (первые пять машин получил Центральный аэроклуб им. В. П. Чкалова в Москве). В1952 году первые самолеты поступили в штабные эскадрильи ВВС и ВМФ. В феврале 1959 года Ейское ВАУЛ стало применять Ан-2 для летной и парашютной подготовки курсантов, а через два года им обзавелись все летные училища.
После появления самолета пилоты присвоили ему наименование «Аннушка», которое закрепилось за ним на всю жизнь.
Ан-2 разных модификаций по сей день широко используются в сельском и лесном хозяйстве, для перевозки пассажиров и грузов на местных авиалиниях (к 1977 году они обслуживали 3254 населенных пункта), тренировки парашютистов в аэроклубах и частях Воздушно-десантных войск (ВДВ), аэрофотосъемки и геологоразведки, разведки льдов, рыбы и морского зверя, разрушения льда путем его опыления черным порошком, мониторинга не-фте- и газопроводов и линий электропередач, обработки реагентами разливов нефти и для решения многих других задач.
К январю 1987 года на Ан-2 было перевезено 370 миллионов пассажиров, 9 миллионов тонн грузов, выполнено 96 % авиахимических работ.
В начале 1950 года ОКБ-153 получило задание от Управления полярной авиации ГВФ на оборудование Ан-2 для работы в Арктике. Для доработок выделили четвертую машину первой серии (заводской № 10147304), при этом ее оборудовали автономным источником электроэнергии, бензиновым обогревателем для отопления салона и подогрева двигателя, дополнительными рабочими местами штурмана и радиста. Ан-2 укомплектовали якорем, стремянкой, бочками с горючим и другим инвентарем, необходимым в Арктике. Постройка самолета проходила под наблюдением полярного летчика М. Н. Каминского, внесшего немало ценных предложений, способствовавших широкому внедрению машины в Заполярье.
В июне 1950 года в Управление полярной авиации ГВФ поступил первый Ан-2 (первый серийный киевского авиазавода № 10147301), с опознавательным знаком СССР — Н545, затем второй — СССР — Н546 (заводской № 10147304). На этих машинах М. Каминский с бортмехаником М. Чагиным и представителем ОКБ-153 А. Эскиным с 15 июня по 26 ноября 1950 года налетали в Арктике и на Чукотке около 800 часов и выполнили более 100 посадок на выбранные с воздуха площадки. Все полеты проходили на колесном шасси, а в Заполярье и Арктике требовалось прежде всего лыжное шасси.
Испытания Ан-2 на лыжном шасси завершились в апреле 1952 года. Металлические лыжи были впервые снабжены тормозами гребенчатого типа с пневмоуправлением. Благодаря этому управляемость Ан-2 при движении по снегу сохранилась практически такой же, как на колесах. Главной проблемой, затруднявшей применение самолетов на лыжном шасси, было примерзание их полозьев к снежному насту на стоянке. Решить ее пытались с помощью электрообогрева полозов, но дальше опытов дело не пошло. Так и мучились экипажи, пока в Польше не предложили приклеивать к полозам полиэтиленовые накладки. Но и эта конструкция полностью не исключала примерзание, к тому же полиэтилен от мороза и трения трескался и разрушался. Все кончилось тем, что с 1970 года в Польше построили новый полярный вариант Ан-2ПК с устройством электроподогрева лыж.
Со временем широкое применение Ан-2 привело к подлинному перевороту в освоении крайних широт страны. Каминский говорил:
Начиная с 1954 года Ан-2 начали использовать для организации и обслуживания дрейфующих полярных станций. Первой из них стала «Северный полюс-4», а год спустя станцию «Северный полюс-5» стал обслуживать экипаж Ан-2 во главе с М. Н. Каминским.
В условиях полярной ночи 1955–1956 годов его Ан-2 доставил в лагерь 80 тонн грузов. Без Ан-2 и по сей день не обходится ни одна полярная экспедиция.