После завершения эксплуатационных испытаний, 23 сентября 1963 года из московского аэропорта Быково Ан-24 отправился в первый пассажирский рейс в Саратов с промежуточной посадкой в Воронеже. В последний день октября началась эксплуатация Ан-24 на авиалинии Киев — Херсон. Два месяца спустя постановлением правительства самолет приняли на снабжение Аэрофлота, хотя его взлетно-посадочные характеристики оставляли желать лучшего.
В том же году на Ан-24 была выполнена первая безмоторная посадка. Произошло это в летном училище во время тренировочного полета с последовательным выключением и запуском одного из двигателей. Курсант согласно инструкции выключил один из двигателей, винт которого занял флюгерное положение. При последующих действиях, вследствие ошибки, курсант вместо того, чтобы запустить остановленный мотор, выключил работающий. Все происходило на высоте около 3000 метров. Попытки запустить остановленные двигатели не увенчались успехом, и тогда управление взял инструктор, бывший планерист А. Богдасаров.
Ан-24 далеко не паритель, но пилот-инструктор, снижаясь с вертикальной скоростью 4 м/с, посадил машину на своем аэродроме, а учебно-тренировочный полет по сути стал испытательным и для экипажа, и для самолета.
К концу 1963 года в Аэрофлоте эксплуатировалось 24 Ан-24А с убытком, достигавшим 35 процентов. Для повышения экономичности самолета в 1964 году провели работы по увеличению взлетного веса самолета с 19 500 кг до 20 000—21 000 кг.
Самолет уже почти два года перевозил пассажиров, но его еще не экспонировали ни на одном зарубежном авиасалоне и сделали это лишь в 1965-м, продемонстрировав в Ле Бурже. В октябре того же года первый Ан-24, пилотируемый летчиком А. Я. Евдокимовым, прилетел в Якутск.
По данным Аэрофлота, по май 1969 года самолеты Ан-24 перевезли в Советском Союзе более 25 миллионов пассажиров и свыше 350 тысяч тонн грузов.
Первым на ледовый аэродром станции «Северный полюс-21» произвел посадку Ан-24 СССР — 47250 в мае 1972 года. В том же году заговорили о замене двигателей АИ-24 2-й серии более мощными АИ-24Т.
В течение десяти лет турбовинтовой мини-лайнер вытеснил с авиалиний Ли-2 и Ил-14.
Пассажирские варианты Ан-24 строились серийно Киевским и Улан-Удинским заводами, где было выпущено 1028 и 174 самолетов соответственно.
Несмотря на высокие экономические и летные данные, эксплуатация Ан-24 не обходится без жертв. Причин хватает, это и человеческий фактор, на долю которого приходится около 70 процентов всех случаев, и отказы техники. Первая трагедия с Ан-24 произошла 20 марта 1965 года. В тот день потеряли самолет с опознавательным знаком СССР — 46474 (командир Коздовских) 120-го летного отряда Уральского управления гражданской авиации.
С декабря 1967-го по август 1973 года гражданская авиация недосчиталась десяти машин, а новый, 1974 год в который раз начался с трагического известия. 6 января в районе Мукачево все 24 пассажира, находившиеся на борту самолета СССР — 46357, погибли. А дальше — больше.
В следующем году Аэрофлот недосчитался двух Ан-24. 17 ноября в районе Сухуми из-за столкновения с землей произошла катастрофа самолета с опознавательным знаком СССР — 46467. Погибло 38 человек. Три дня спустя в районе Харькова еще одна трагедия. Катастрофа самолета Ан-24 СССР — 46349 унесла жизни 19 человек.
В 1976 году — еще три трагедии. 15 мая в районе Чернигова Ан-24 СССР — 46534 вышел на режим сваливания. Это стоило жизни 52 человекам.
17 декабря 1976 года катастрофа Ан-24 СССР — 46672 в районе Киева. Самолет разрушился при посадке в сложных метеоусловиях.
Столкновение воздушных судов в полете не редкость, хотя их и оснащают системами предупреждения. 30 лет назад о таком оборудовании и понятия не имели, а потому и риск столкновения был довольно высок. Так, 9 сентября в районе Адлера столкнулись в воздухе Ан-24 СССР — 46518, летевший из Донецка в Сочи, и Як-4 °CССР — 87772, выполнявший рейс Ростов-на-Дону — Керчь. Ошибка службы УВД на фоне недостаточной радио- и визуальной осмотрительности у обоих экипажей стоила жизни 90 человекам.
24 августа 1981 года в районе Завитинска произошла вторая похожая трагедия с Ан-24. Из-за ошибки наземных служб столкнулись ракетоносец Ту-16К из 303-го тяжелобомбардировочного авиаполка 55-й авиадивизии 30-й воздушной армии, взлетевший для выполнения маршрутного полета, и рейсовый Ан-24 (СССР — 46653) Дальневосточного управления гражданской авиации. Несогласованность действий служб УВД ГА и ВВС на фоне недостаточной радио- и визуальной осмотрительности экипажей привела к гибели 31 человека.
За две недели до нового, 1977 года при посадке в сложных метеоусловиях в районе Киева упал Ан-24 СССР — 46672. Из 55 человек погибли — 48. 12 сентября того же года в катастрофе Ан-24 (СССР — 47695) погибли 17 человек.
15 января 1979 года еще одна трагедия, на этот раз в районе Минска. Катастрофа самолета Ан-24 (СССР — 46807) унесла жизни 13 человек. 3 сентября того же года гибнет Ан-24 СССР — 46269. Из 43 человек 40 погибли.