Обмен веществ и энергии в клетках организма

В качестве объекта эксперимента была использована кишечная палочка, которая содержит в клетке всего одну молекулу ДНК. Для выяснения правильной версии бактерии выращивались на питательной среде, содержащей радиоактивный изотоп азота ¹⁵N. Через несколько поколений ДНК всех бактерий содержали изотоп ¹⁵N (рис. 24).

Puc. 24. Гипотезы процесса репликации ДНК: 1. А — консервативная; Б — полуконсервативная; В — фрагментарная. II. Результат центрифугирования молекулы ДНК бактерий

Методом центрифугирования эти ДНК были выделены из клеток в виде отдельной фракции, что доказывало, что ДНК всех бактерий имеют одинаковый изотопный состав. Далее бактерии, содержащие в ДНК только изотоп ¹⁵N, были перенесены на питательную среду с обычным изотопом азота ¹⁴N. Центрифугирование ДНК нового поколения бактерий показало, что эти молекулы содержали азот ¹⁴N и ¹⁵N, но их невозможно было разделить по массе на фракции. Следовательно, оба изотопа находились в одной молекуле ДНК. Первая версия о консервативном способе репликации ДНК была отвергнута, так как отсутствовали отдельные фракции ДНК с ¹⁴N и ДНК с ¹⁵N.

Для проверки двух оставшихся версий были исследованы ДНК третьего поколения бактерий. Их удалось четко разделить на две фракции: ДНК (¹⁴N) и ДНК (¹⁴N, ¹⁵N). Таким образом, отпала третья версия о фрагментарной репликации ДНК. Эксперимент позволил установить, что ДНК синтезируется полуконсервативным способом.

В основе репликации ДНК лежат следующие принципы.

Комплементарность. Каждая цепь молекулы ДНК содержит последовательность нуклеотидов, в точности комплементарную последовательности нуклеотидов на другой цепи. Следовательно, новые молекулы несут одну и ту же генетическую информацию: цепь А является шаблоном для синтеза цепи А', а цепь А' — шаблоном для синтеза цепи А.

Полуконсервативный синтез. Если разделить цепи А и А' одной молекулы ДНК, то каждая из них будет служить матрицей для синтеза соответствующей недостающей цепи. Новые молекулы ДНК будут содержать одну новую и одну исходную материнскую цепь ДНК. Две дочерние молекулы ДНК полностью идентичны исходной материнской.

Антипараллельность. Две цепи в молекуле ДНК антипараллельны. Это значит, что у нуклеотида в начале одной цепи находится остаток дезоксирибозы со свободной гидроксогруппой (-OH) у 3'-атома углерода, а у комплементарного ему нуклеотида в начале другой цепи находится остаток фосфорной кислоты, соединенный с 5'-атомом углерода дезоксирибозы. Соответственно, первая цепь заканчивается нуклеотидом с 5'-концом, а вторая цепь — нуклеотидом с 3'-концом.

Челночный синтез. Фермент ДНК-полимераза, обеспечивающий синтез новой цепи ДНК на матрице исходной цепи, соединяет нуклеотиды только в направлении от 5'-нуклеотида к 3'-нуклеотиду. Поэтому синтез идет на одной цепи вперед в направлении 5'—3' непрерывно, а затем по другой цепи назад к 5'-концу фрагментами. Отдельные фрагменты соединяются позже.

Процесс репликации протекает в три стадии.

Стадия I — инициация. Репликация молекулы ДНК начинается с разъединения двойной спирали с одного конца, причем процесс идет не на всем участке молекулы, а частями, фрагментарно. Эта реакция проводится в присутствии нескольких белковых факторов. Две цепи в молекуле ДНК связаны достаточно прочно, поэтому для их разъединения необходимы специальные белки. Белки первого типа, перемещаясь по молекуле ДНК, раскручивают спираль и разрушают водородные связи между комплементарными основаниями, расплетая двойную спираль. Белки второго типа предотвращают повторное соединение двух цепей и обеспечивают эффективность действия белков первого типа. Кроме того, они выпрямляют одиночные цепи ДНК и обеспечивают продвижение фермента ДНК-полимеразы, который катализирует синтез новых цепей. В результате действия всех белковых факторов образуется репликационная вилка (рис. 25).

Рис. 25. Репликация ДНК: I — строение репликационной вилки: 1 — ДНК-расплетающий белок; 2 — ДНК-связывающий белок; 3 — ДНК-полимераза; II — синтез ДНК на ведущей и отстающей цепи (стрелками показано направление синтеза и перемещение ДНК-полимеразы)