Прежде, чем мы перечислим эти возможные причины повреждений при заморозке, следует отметить, что «не выживают» — это очень неопределенное и, возможно, вводящее в заблуждение выражение. Обычный критерий выживания — это возобновление функционирования в случае с органом или рост клеточной культуры или успешная трансплантация или автореплантация (пересадка ткани обратно в животное-донор) в случае с тканью. Ткань, находящаяся лишь немного ниже границы выживания называется «мертвой», а эксперимент, в котором лишь небольшая доля клеток выживает, обычно считается неудавшимся. Но на самом деле, почти удавшиеся и частично удавшиеся эксперименты дают значительные основания для оптимизма, поскольку они указывают на сравнительно небольшой объем повреждений.
Ниже перечислено несколько отдельных видов повреждений при заморозке, хотя не все из них являются взаимоисключающими.
1. Возможны механические повреждения при формировании кристаллов льда.
Наиболее очевидная возможность повреждений связана с колющим, давящим или разрывающим действием формирующихся ледяных кристаллов на клеточные мембраны и целые клетки. Странно, однако, что подобные результаты наблюдаются довольно редко, хотя иногда это и может происходить. (В случае с растительными клетками, с их более жесткими мембранами, подобные повреждения происходят намного легче.)
При медленном охлаждении со скоростью около одного градуса в минуту чистый лед постепенно отделяется от клеточного раствора, и кристаллы льда формируются за мембраной в межклеточном пространстве. Более медленное охлаждение увеличивает размер формирующихся кристаллов и уменьшает их число; более быстрое охлаждение — наоборот. По достижении так называемой эвтектической температуры[21]
остаток раствора замерзает и превращается в смесь кристаллов льда и различных солей и гидроксидов.Существует достаточно доказательств того, что формирование кристаллов льда не всегда смертельно, несмотря на то, что вода при замерзании расширяется. Меримен пишет: «Экспериментальные работы в области обморожений показали, что нога собаки может выдержать охлаждение тканей до температур существенно ниже точки замерзания на время до тридцати минут… Нет никакого сомнения, что ледяные кристаллы формируются, но, несмотря на это, ткань выживает… довольно уверенно можно утверждать, что в мягких тканях, свойственных представителям Царства животных, возможно формирование ледяных кристаллов в межклеточном пространстве и значительное сжатие ими клеток без негативного воздействия на выживаемость последних». (70)
При быстрой заморозке формируются кристаллы льда значительно меньшего размера, и, возможно, именно поэтому, опасность механических повреждений намного меньше, хотя общий объем льда, естественно, не меняется. С другой стороны, при быстрой заморозке вода не успевает покинуть клетку, из-за чего формируются небольшие внутриклеточные или даже внутриядерные кристаллы льда, что создает опасность повреждений. Размер этой опасность сложно оценить, но она может быть значительной — кристаллы льда могут, к примеру, повредить ядро клетки.
2. Возможна опасная концентрация электролитов.
Поскольку заморозка вызывает разделение воды (в виде льда) и растворенных в воде веществ, происходит дегидратация. Жидкость, остающаяся в клетке имеет необычайно высокую концентрацию солей и других веществ с близким строением, называемых «электролитами», которые обладают особыми электрическими и химическими свойствами. Подобные значительные изменения внутри клетки могут быть для нее губительными. (69)
Повреждения клетки зависят от концентрации электролитов, времени воздействия и температуры; меньшая температура означает меньшую скорость реакции. В зависимости от типа клетки и других факторов, концентрация электролитов становится опасно высокой при температурах от 0 C° до –25 C°. Следовательно, при отсутствии защитных вливаний охлаждение в этом интервале температур должно быть максимально быстрым.
Доктор Джей. Э. Лавлок полагает, что особой опасности денатурирования и изменения химических свойств подвержены липопротеины. «Частым, если не постоянно встречающимся, компонентом многих мембран в сложной живой клетке являются липо-протеидные комплексы… связанные не сравнительно сильными ковалентными связями, соединяющими атомы в простом белке, но слабыми ассоциативными силами, схожими с теми, что поддерживают мыльный пузырь… Эти комплексы часто нестабильны и, вероятно, постоянно обновляются с помощью внутриклеточного синтеза… Заморозка [легко может] денатурировать более чувствительные липопротеиновые комплексы живой клетки.