Второй храм обители — собор Св. Духа, находился рядом с Троицким.
В этом храме, чьё строительство начато в 1830 году первой игуменьей Афанасьевского женского монастыря Евпраксией и завершено в 1841 г. второй игуменьей — Магдалиной, которые обе и были впоследствии похоронены под правым Тихвинским приделом собора, хранилось много монастырских святынь, в том числе часть мощей св. Афанасия, патриарха Александрийского. «Сия святыня была принята в монастырь в 1845 году по словесной резолюции преосвященного Евгения, архиепископа Ярославского и Ростовского, от помещика Московской губернии, села Новоспасского Гавриила Головина», — как записано в монастырских документах. Она находилась в особо устроенном серебряном ковчеге под стеклянным футляром при образе св. Афанасия и Кирилла.
Отец Павел называет также местную икону Сошествия Святаго Духа, больших размеров в дорогостоящей ризе, прекрасные иконы св. великомученика и целителя Пантелеимона, св. преподобного Серафима Саровского и святителя Феодосия, высокохудожественной работы огромную икону Иверской Божией Матери и, кроме того, плащаницу рукоделия сестер обители.
Шитая по малиновому бархату золотом, блестками и серебром, со вставленными в венцы драгоценными камнями и жемчугом, плащаница изображала положение во гроб Иисуса Христа и хранилась в стеклянном футляре за правым клиросом собора. В иконостасе самым замечательным был местный образ Вседержителя, при нем находилась частица мощей святой великомученицы Варвары; славилась и местного письма Толгская икона Божией Матери в полу-жемчужной ризе и с серебряным крестом, в который были помещены частички мощей неизвестных святых.
Первый корпус, с южной стороны, двухэтажный, был административный, в нем помещались игуменья и другие монахини. Перед ним был разбит небольшой фруктовый сад и цветник.
С западной стороны прилегал двухэтажный корпус, где находились сестринские кельи и различные мастерские, в нем было шесть крыльцов, а посередине корпуса — Святые ворота.