Узбекско-американские отношения пошли под откос из-за андижанского кризиса, который в итоге привел к закрытию американской авиабазы К-2 в Карши-Ханабаде. В июне 2004 года узбекская полиция взяла под стражу 23 частных предпринимателей из Андижана, города на востоке Узбекистана, по обвинению в «экстремизме, фундаментализме и сепаратизме». Все задержанные принадлежали к исламистской организации под названием «Акрамия» – она занималась благотворительностью и поддерживала возможности трудоустройства в регионе. Сами арестованные отрицали все обвинения. В 2005 году начался суд над ними, и ожидалось, что вердикт будет оглашен 12 мая. Накануне оглашения вердикта снаружи здания суда собралась толпа. В ночь с 12 на 13 мая в здание тюрьмы, где содержались обвиняемые, ворвалась группа вооруженных людей, освободила арестантов и направилась к зданию областной администрации; оно было захвачено, а представители власти взяты в заложники. Затем мятежники попытались захватить штаб-квартиру местных органов безопасности. На улицы вышли толпы митингующих. Они захватили и удерживали центральную площадь Андижана. Каримов лично прилетел в Андижан, чтобы оценить обстановку. Спустя сутки мятеж был жестоко подавлен, многие протестующие были убиты правительственными войсками. Данные о количестве жертв сильно расходятся: по официальной оценке властей Узбекистана, погибли триста человек, но реальное число жертв могло достичь полутора тысяч – такие данные привел сотрудник узбекских спецслужб, бежавший на Запад.
Спустя годы после мятежа в Андижане все еще сохраняются разногласия по его фактическим обстоятельствам, и однозначной трактовки этих событий нет. Спорят и о том, кто были эти 23 предпринимателя и их сторонники, и о том, насколько адекватной была реакция правительства. В своих мемуарах Дональд Рамсфельд утверждает, что предприниматели принадлежали к исламской экстремистской группировке. Видеоматериалы, отснятые «Акрамией», позволяют сделать вывод, что протестующие были вооружены. Однако с этим не соглашаются организация Human Rights Watch и другие НПО: по их версии, предприниматели были не фундаменталистами, а мирными исламистами, и правительственные силы без разбора применяли чрезмерную силу против гражданского населения.
Через две недели после кризиса в Андижане сенаторы Джон Маккейн и Линдси Грэм прибыли в Ташкент, осудили режим Каримова за убийство граждан своей страны и призвали правительство США задержать следующий транш платежей Узбекистану за пользование авиабазой. Правительство Узбекистана не дало согласия на прибытие международной комиссии по расследованию массового убийства мирных граждан, как предлагали Соединенные Штаты и Евросоюз. Россия и члены Шанхайской организации сотрудничества – куда входят помимо России и Китая государства Центральной Азии – в данном вопросе поддержали Каримова. Евросоюз наложил эмбарго на поставки вооружений Узбекистану, далее последовала эскалация взаимных обвинений между Ташкентом и властями стран Запада. В июле 2005 года правительство Узбекистана информировало Вашингтон о нежелательности использования Соединенными Штатами авиабазы К-2. В ноябре того же года Россия и Узбекистан подписали Договор о дружбе. Как в Вашингтоне, так и в Москве события в Андижане и их последствия рассматривались как потеря для интересов США в Центральной Азии и как чистая выгода для Кремля.