После смерти жены, в царствование императора Константина Великого (306—337), его хиротонисали во епископа кипрского города Тримифунта. В сане епископа святитель не изменил своего образа жизни, соединив пастырское служение с делами милосердия. По свидетельству церковных историков, святитель Спиридон в 325 году принимал участие в деяниях I Вселенского Собора. На Соборе святитель вступил в состязание с греческим философом, защищавшим ересь арианства. Простая речь святителя Спиридона показала всем немощь человеческой мудрости перед Премудростью Божьей: «Слушай, философ, что я буду говорить тебе: мы веруем, что Всемогущий Бог из ничего создал Своим Словом и Духом небо, землю, человека и весь видимый и невидимый мир. Слово это есть Сын Божий, Который сошел ради наших грехов на землю, родился от Девы, жил с людьми, пострадал, умер для нашего спасения и затем воскрес, искупив Своими страданиями первородный грех, и совоскресил с Собою человеческий род. Мы веруем, что Он Единосущен и Равночестен со Отцем, и веруем этому без всяких лукавых измышлений, ибо тайну эту постигнуть человеческим разумом невозможно». В результате беседы противник христианства сделался его ревностным защитником и принял святое крещение в лоне истинной церкви.
После разговора со святым Спиридоном, обратившись к своим друзьям, философ сказал: «Слушайте! Пока состязание со мною велось посредством доказательств, я выставлял против одних доказательств другие и своим искусством спорить отражал все, что мне представляли. Но когда, вместо доказательства от разума, из уст этого старца начала исходить какая-то особая сила, доказательства потеряли силу против нее, так как человек не может противиться Богу. Если кто-нибудь из вас может мыслить так же, как я, то да уверует во Христа и вместе со мною да последует за этим старцем, устами которого говорил Сам Бог». На том же Соборе святитель Спиридон явил против ариан наглядное доказательство Единства во Святой Троице. Он взял в руки кирпич и стиснул его; мгновенно вышел из него вверх огонь, вода потекла вниз, а глина осталась в руках чудотворца. «Се три стихии, а плинфа (кирпич) одна, – сказал тогда святитель Спиридон, – так и в Пресвятой Троице – Три Лица, а Божество Едино».
Святитель с большой любовью заботился о своей пастве. По его молитве засуха сменялась обильным животворящим дождем, а непрерывные дожди – солнечной погодой, исцелялись больные, изгонялись демоны. Однажды к нему пришла женщина с мертвым ребенком на руках, прося заступничества святого. Помолившись, он вернул младенца к жизни. Мать, потрясенная радостью, упала бездыханной. Но молитва угодника Божьего вернула жизнь и матери. Как-то, спеша спасти своего друга, оклеветанного и приговоренного к смерти, святитель был остановлен в пути неожиданно разлившимся от наводнения ручьем. Святой приказал потоку: «Стань! Так повелевает тебе Владыка всего мира, дабы я мог перейти и спасен был муж, ради которого спешу». Воля святителя была исполнена, и он благополучно перешел на другой берег. Судья, предупрежденный о происшедшем чуде, с почетом встретил святого Спиридона и отпустил его друга.
Известен из жизни святителя и такой случай. Как-то он зашел в пустую церковь, повелел возжечь лампады и свечи и начал богослужение. Провозгласив «Мир всем», он и диакон услышали в ответ сверху раздавшееся «великое множество голосов, возглашающих: «И духови твоему». Хор этот был велик и сладкогласнее всякого пения человеческого. На каждой ектений невидимый хор пел «Господи, помилуй». Привлеченные доносившимся из церкви пением, к ней поспешили находившиеся поблизости люди. По мере того, как они приближались к церкви, чудесное пение все более и более наполняло их слух и услаждало сердца. Но, когда они вошли в церковь, то не увидели никого, кроме епископа с немногими церковными служителями, и не слыхали уже более небесного пения, от чего пришли в великое изумление».
Святой Симеон Метафраст, описатель его жития, уподоблял святого Спиридона патриарху Аврааму в добродетели гостеприимства. «Надобно знать и то, как он принимал странников», – писал близкий к монашеским кругам Созомен, приводя в своей «Церковной истории» удивительный пример из жизни святителя. Однажды по наступлении Четыредесятницы в его дом постучался странник. Видя, что путник очень утомлен, святой Спиридон сказал дочери: «Обмой-ка ноги этому человеку да предложи ему поесть». Но ввиду поста не было сделано нужных запасов, ибо святитель «вкушал пищу только в определенный день, а в прочие оставался без пищи». Поэтому дочь ответила, что в доме нет ни хлеба, ни муки. Тогда святой Спиридон, извинившись перед гостем, приказал дочери поджарить бывшее в запасе соленое свиное мясо и, усадив за стол странника, принялся за трапезу, «убеждая того человека подражать себе. Когда же последний, называя себя христианином, отказался, – тот прибавил: «Тем менее надобно отказываться, ибо Слово Божие изрекло: «Вся чиста чистым» (Тит. 1,15)».