Простое начало. Как четыре закона физики формируют живой мир

Пока что мы изображали систему CRISPR/Cas9 исключительно деструктивной, расщепляющей ДНК в нужном месте. Благодаря этому ее свойству мы можем инактивировать ген. Клетки обладают механизмами выявления и починки повреждений ДНК. Такие системы репарации необходимы прежде всего для устранения дефектов, рутинно возникающих в ходе репликации ДНК, а также под действием побочных продуктов обмена веществ или физических факторов вроде ультрафиолета. Восстановлением ДНК занимаются белки, сшивающие друг с другом концы рассеченных цепей. Но при этом нередко возникают ошибки: нуклеотиды на стыке могут замениться, добавиться или выпасть. Такие ошибки часто приводят к синтезу нефункционального белка.

Природный инструментарий починки ДНК можно использовать и более конструктивно – например, для внедрения в геном новых последовательностей. Мы можем ввести в клетку фрагменты ДНК с любым желательным для нас геном. Ремонтные белки непривередливы: они сшивают любые концы ДНК, которые находят, – и с их помощью один из наших фрагментов может попасть в разрыв цепей и с обеих сторон соединиться с геномом. Возможно, вы уловите в выражении «может попасть» немало неопределенности, и будете правы: вероятностная природа микроскопического мира здесь проявляется сполна. Расщепленные Cas9 свободные концы ДНК перемещаются по законам броуновского движения. Белки, которые выявляют и чинят поврежденную ДНК, тоже блуждают. Какую пару они найдут раньше – свободный конец геномной ДНК и конец введенного в клетку фрагмента либо два свободных конца генома, – зависит от траектории их случайных перемещений, хотя мы и можем влиять на результат введением в клетку множества копий нужного гена, и тогда белок с большей вероятностью наткнется именно на него. Cas9 между тем останется в клетке – он может опять найти свою ДНК-мишень, расщепить ее и повторять процесс снова и снова. У нас есть шанс получить желаемый результат, но нет в этом уверенности. Как и в случае старых методов, нам придется совершить много ошибок, прежде чем мы добьемся успеха. Тем не менее, если все выходит как задумано, этот метод позволяет поместить наш ген ровно в то место генома, где мы хотим его видеть.

Хотя программируемые системы CRISPR/Cas9 появились от силы 10 лет назад, ученые уже изобрели более удобные схемы внедрения генетического материала. Перспективный метод праймированного редактирования, разработанный в 2019 году группой Дэвида Лю из Института Эли и Эдит Броуд, задействует широкий спектр клеточных механизмов²⁶. Я не буду вдаваться в детали, но по сути он сплавляет модифицированный Cas9 с обратной транскриптазой – белком, формирующим ДНК на матрице РНК (см. главу 13), – и включает в РНК-гид ту самую матрицу для внедряемой, измененной по сравнению с геномной последовательности ДНК. Химера из Cas9 и обратной транскриптазы узнает и разрезает в нужном месте одну из цепей геномной ДНК, а затем в месте разреза синтезирует по матрице гидовой РНК новую ДНК, уже с желаемыми изменениями. Лишний фрагмент старой цепи должны отрезать клеточные ферменты. Рисунок дает общее представление об этом многоэтапном процессе[68]: ДНК обозначена черным, РНК – серым, на измененную последовательность указывают стрелки; белок не представлен.

Группа Лю успешно применила праймированное редактирование в клеточных культурах мыши и человека и отметила, что эта техника принципиально пригодна для исправления 89 % генетических вариантов, ассоциированных с болезнями человека. (В оставшиеся 11 % входят, например, множественные копии генов, с которыми не справиться простым переписыванием участка ДНК.)

В этой искусной подгонке ДНК с помощью иголок и ниток – белков и нуклеотидов – находит отражение физическая природа биологических молекул. ДНК – это носитель генетической информации, и чтобы изменить эту информацию, мы создаем инструменты, позволяющие нам без визуального контроля захватывать, разрезать, вставлять и сшивать ДНК-фрагменты. Точность операций поражает даже с небиологической точки зрения. Размеры некоторых деталей новейших компьютерных микросхем не превышают 10 нанометров. Длина одного нуклеотида ДНК составляет около 1/3 нанометра, но его можно контролируемо заменять с помощью праймированного редактирования и других новейших подходов.