Получив в 1911 г. степень доктора медицины, Хорни стала работать в различных медицинских учреждениях Берлина, в частности в психиатрической клинике Карла Бонхофера. Ее докторская диссертация называлась «Посттравматические психозы» и была посвящена вопросу о том, какую роль органические и психологические факторы играют в возникновении болезненных психических симптомов. Именно этот вопрос был, по сути, центральным в развернувшейся в те годы дискуссии о клиническом применении психоанализа.
Впервые Хорни обратилась к психоанализу в качестве пациентки в связи с обострением в 1911 г. депрессии и тревожности. Эти симптомы возникли как следствие глубоких переживаний, вызванных смертью матери. Свою роль сыграли и двойственное отношение к отцу, и внутреннее противоречие между карьерой и домом, и накапливавшиеся проблемы в супружеских отношениях. Аналитиком Хорни выступил Карл Абрахам, один из ближайших сотрудников 3. Фрейда. Курс, однако, не был завершен и прервался менее чем через год. В своем дневнике Хорни записала, что разочарована результатами лечения. Это тем не менее не повлияло на возникновение у нее искреннего и глубокого интереса к психоанализу. (В 1921 г. она предприняла еще одну попытку; аналитиком выступил Ганс Сас; курс продлился шесть месяцев.) Освоив психоаналитический метод, Хорни с 1919 г. вела собственную практику и активно сотрудничала в Берлинском психоаналитическом институте, сначала как лектор (преимущественно по теме женской психологии), затем как клинический аналитик, позднее как аналитик-куратор.
В начале 20-х гг. и ранее неблагополучные отношения с мужем еще более обострились. Оскар Хорни, весьма преуспевший в коммерции в годы Первой мировой войны и первые послевоенные годы, в результате инфляции в 1923 г. потерпел финансовый крах и был объявлен банкротом. Вызванные этим тяжелые переживания и последовавшее вскоре неврологическое заболевание грубо исказили его характер. Супруги Хорни фактически разошлись в 1926 г.; в 1937 г. был юридически оформлен развод.
Ранние научные публикации Хорни были посвящены психологии женщин и женской сексуальности, причем уже в статьях 20-х гг. звучат мотивы критической переоценки теории Фрейда. Хорни отвергала «фаллоцентрическую» ориентацию психоанализа, настаивала на необходимости учета своеобразия женской психики в противовес ее выведению из мужской. Собственный опыт неблагополучных семейных отношений также нашел косвенное отражение в публикациях этого периода.
В 1932 г. Хорни приняла приглашение своего бывшего берлинского коллеги Франца Александера и переехала в США. Она поступила на работу во вновь созданный Чикагский институт психоанализа, директором которого был Александер. Неудовлетворенность догматичной атмосферой Берлинского института породила у нее стремление к большей самостоятельности и свободе выражения, которые она рассчитывала обрести в Америке. К тому же поднимавший голову нацизм клеймил психоанализ как вредную еврейскую псевдонауку. Хорни не была еврейкой и не занималась политикой, но складывавшаяся атмосфера не могла не стимулировать ее отъезд.
В Чикаго Хорни провела всего два года. Порядки, заведенные Александером в институте, пришлись ей не по душе. С директором у Хорни не сложились нормальные отношения, не говоря уже о сугубо научных разногласиях. Оказавшись в Америке в новой для себя социальной атмосфере, Хорни все более настойчиво подчеркивала влияние социальных факторов на психологию женщин. Ее рассуждения все далее отходили от постулатов классического фрейдизма, что встретило крайнее неодобрение Александера.
В 1937 г. вышла ее первая книга — «Невротическая личность нашего времени», посвященная анализу роли социальных факторов в возникновении неврозов. В своей второй книге — «Пути психоанализа» — Хорни фактически провозгласила собственный подход к душевной жизни человека, связанный с критической переоценкой постулатов фрейдизма. На этой почве ею совместно с Э. Фроммом, Г. Салливеном и др. в 1941 г. была основана новая Ассоциация развития психоанализа. При Ассоциации был создан Американский институт психоанализа, Хорни стала его деканом. Ею также был основан печатный орган Ассоциации — «Американский журнал психоанализа», главным редактором которого она была до конца жизни.