Композиция «Диспута» напоминает огромную апсиду раннехристианского храма с широкими мраморными ступенями, ведущими к алтарю, на котором установлена дарохранительница с облаткой, называемой просвирой или
Главными контрастными тонами являются синий и жёлтый, интенсивные в земной половине и более лёгкие и размытые в небесной. Фреска носит сугубо программный характер, что отражено на четырёх табличках в руках резвых путти, устремляющихся к миру земному вместе с голубем, олицетворяющим Святой Дух Троицы, пребывающей в заоблачных высях.
Если сложить вместе разрозненные таблички, то текст читается так: «Jurisprudentia est divinarum atque humanarum rerum notitia, justi atque injusti scientsia», то есть «Юриспруденция есть знание божественных и человеческих вещей, наука о справедливом и несправедливом».
Работа над «Диспутом» изрядно утомила Рафаэля. Под постоянным контролем приставленных советников ему приходилось строго соблюдать церковную иерархию, рассаживая по обе стороны от Святой Троицы апостолов, пророков и святых мучеников. Первым сидит Пётр, изображённый в профиль. Здесь же Иоанн Богослов, погружённый в чтение Евангелия и не слышащий, что ему говорит царь Давид. Мученик Стефан указывает, по-видимому, пророку Иеремии на происходящее на земле. По другую сторону от Святой Троицы едва различимый Георгий-воин и дьякон Лаврентий с пальмовой ветвью мученика, увлечённо наблюдающий за полётом ангелов. Рядом пророк Моисей со скрижалями и задумавшийся апостол Иаков с книгой на коленях. Пророк Авраам, повернувшись, смотрит на апостола Павла, замыкающего ряд и изображённого в профиль. Не забыт и праотец — полуобнажённый Адам, сидящий рядом с Петром. Его вальяжная поза несколько нарушает картину чинно восседающих небожителей. Сидя нога на ногу, Адам всем своим простодушным видом выражает радость существования, хотя и не на земле.
Совсем иная картина на нижней, земной половине фрески, где художник позволил себе некоторую вольность, разместив известных церковных иерархов, трёх пап, четырёх епископов и простолюдинов вокруг алтаря, покрытого голубым покрывалом с арабесками на возвышении с потиром и остией. Одни ведут между собой неспешный разговор, другие пребывают в духовном созерцании. Слева от алтаря восседает папа Григорий Великий, устремивший взор к небу. Рядом с ним сидит блаженный Иероним со львом у его ног. Над ним возвышается, как принято полагать, святой Бернард, указывающий обеими руками на остию и как бы говоря, что всякие рассуждения напрасны, если пред нами искупительное тело Христово. Ему вторит такой же старец по другую сторону алтаря. Возможно, это Пьетро Ломбардо, ученик французского философа XII века Абеляра. Его поднятая к небу рука красноречиво говорит о том, что в «Диспуте» вместо споров теологов и дискуссий безоговорочно утверждается триумф веры и правоты богословской догмы.
По правую сторону от алтаря стоят два понтифика в митрах и парадных одеяниях: Анаклет, третий после Петра папа римский, и Иннокентий III. Между ними святой Августин с книгой в руках что-то вещает, а сидящий на ступени в светлом плаще юноша торопливо записывает его слова. Здесь же Отцы Церкви — Фома Аквинский, Амвросий и Бонавентура.
Особенно живо и выразительно написаны персонажи слева от алтаря на фоне пейзажа с воздвигаемым строением — намёк на строящийся собор Святого Петра. Считается, что смотрящий на увлечённых чтением людей благообразный старец — это живописец Беато Анджелико. А вот старику, прислонившему книгу к парапету, приданы черты Браманте. Он что-то тщится доказать окружающим его людям, заглядывающим в раскрытую книгу. С ним не согласен удаляющийся к алтарю златокудрый юноша в розовой тунике и бирюзовом плаще, написанный в мягкой леонардовской манере. Чуть выше спиной к зрителю рядом с преклонившими колена юнцами стоит учёный муж, задрапированный в голубой паллиум. Он задумчиво глядит на алтарь и указывает рукой на лежащие книги у его подножия, словно олицетворяя собой греко-римский мир, который принимает христианство.