Самая главная молекула

Способность ДНК-полимеразы удлинять праймер была хорошо известна до Фредерика Сэнгера. То, что придумал Сэнгер и что принесло ему вторую Нобелевскую премию по химии (первую он получил за то, что научился читать аминокислотные последовательности белков; пока что Сэнгер – единственный в истории, кто был дважды удостоен Нобелевской премии по химии), это добавлять в смесь четырех дНТФ небольшую примесь одного из четырех ди-дНТФ, скажем, ддАТФ. У дидезокси отсутствуют оба присоединенных к сахару кислорода (рис. 6, 9), и, хотя они способны сами включаться в растущую цепь, на них рост цепи останавливается. В результате включения, скажем, ддАТФ вместо дАТФ возникают оборванные цепи, причем, поскольку ддАТФ присутствует в малой концентрации на фоне избытка дАТФ, обрывы происходят статистически в каждом месте последовательности, где в растущую цепь включается А. Так что, когда реакция удлинения праймера идет в присутствии малой примеси ддАТФ, наряду с длинными цепями, в которые включение ддАТФ не произошло, появится набор более коротких цепей, оборванных сразу за теми местами, где в последовательности матричной цепи стоит Т.

Аналогичные реакции проводят отдельно в присутствии трех остальных ддНТФ. Затем продукты так проведенных четырех реакций удлинения праймера подвергаются разделению по длине методом гель-электрофореза, наслаивая продукт каждой реакции на отдельную дорожку геля. Здесь следует сказать, что второй конец праймера (тот, который не удлинялся, он называется 5 -концом) был заранее помечен флюорофором: молекулой красителя, которая ярко флюоресцирует, если ее освещать светом лазера с определенной длиной волны. Так что после завершения электрофореза гель сканируют лазером и получают систему полосок, схематически показанную на рис. 16. Для данной буквы положение полосок отвечает порядковым номерам в последовательности, в которых стоит данная буква. Разумеется, в современных секвенаторах (так называют машины, читающие ДНКовые тексты) все делается автоматически, и компьютер выдает готовый текст из четырех букв: А, Т, Г и Ц.

Рис. 16. Метод Сэнгера (схема)

Хотя метод Сэнгера был изобретен более 40 лет назад и с тех пор чего только ни напридумывали, чтобы еще лучше и быстрее читать ДНКовые тексты, до недавнего времени он оставался вне конкуренции. Разумеется, современные монстры-секвенаторы на вид ничем не напоминают примитивный аппарат, состоящий из двух стекол с гелем между ними и из источника постоянного тока высокого напряжения, которым пользовался Сэнгер. Вместо флюорофоров он метил праймеры радиоактивным изотопом фосфора, а полоски в геле проявлял по засвечиванию фотопленки. Но при всех технических усовершенствованиях исходный принцип долго оставался без изменения.

Лишь в самые последние годы начали наконец появляться другие методы секвенирования ДНК, способные успешно конкурировать с методом Сэнгера. Но об этом мы поговорим в последнем разделе этой главы.

Первые неожиданности

В науке, да и не только в науке, часто бывает так, что находят вовсе не то, что ищут. Все ждали от первых последовательностей интересных сведений об устройстве промежутков между генами. Было множество предположений о том, как они должны быть устроены. Однако данные оказались разочаровывающими. Ничего особенного, в общем-то, не нашли – последовательности как последовательности. Ожидали, что, расшифровав последовательности нескольких промоторов, которые узнает одна и та же РНК-полимераза, можно будет сразу догадаться, как она это делает. Ан нет, не тут-то было! Хотя последовательности оказались чем-то похожими друг на друга, но чем именно, было не вполне ясно. Так пока и непонятно, как белки узнают определенные последовательности ДНК, каковы принципы такого узнавания. Это одна из проблем, еще ждущих своего решения.

Чего ожидали меньше всего, так это каких-то неожиданностей в самих генах, т. е. в участках ДНК, кодирующих последовательности аминокислот в белках. Ведь код, казалось, был твердо установлен, было четко известно, что каждому белку отвечает свой определенный участок ДНК, который, собственно, и есть ген. Короче, все опять свято верили в незыблемость центральной догмы молекулярной биологии. От шока, вызванного открытием ревертазы, к середине 1970-х годов уже оправились. И вот расшифровали первую ДНК – из вируса кишечной палочки, известного под кодовым названием ФХ174 (читается «фи-десять-сто-семьдесят-четыре»). И вдруг оказалось, что у него на одном и том же участке ДНК записана информация о двух белках!

Как же это может быть? Представьте себе, к вам в руки попала книга, в которой промежутков между словами нет, а слова разделяются стрелками. Сверху строк стоят одни стрелки, а внизу – другие. Деля текст на слова с помощью верхних стрелок, вы читали бы, допустим, «Анну Каренину», а по нижним – «Архипелаг ГУЛАГ». Скажете, это невозможно? Действительно, такого длинного текста, насколько я знаю, не существует. Но короткий текст такого типа я помню с детства. Вот он:

А как обстоит дело у ФХ174, показано на рис. 17.