Самая главная молекула

Открытие Z-формы буквально всколыхнуло души молекулярных биологов. Вместе с доказательством существования крестов в сверхспиральных ДНК это открытие показало, что, хотя в целом ДНК, безусловно, находится в В-форме, отдельные ее участки могут иметь резко отличающуюся структуру. Начался поиск этих и других структур в ДНК и выяснение их возможной биологической роли.

Н-форма

В ходе работы по выяснению возможной биологической роли альтернативных (отличных от В-формы) структур наиболее популярным оказался ферментативный метод, так как он прост и позволяет локализовать на ДНК место атаки однонитевой эндонуклеазы. Дэвид Лилли (Университет Данди, Великобритания) показал, что кресты атакуются в центре перевертыша, а Роберт Уэллс (Алабамский университет, США) обнаружил, кроме того, что при образовании Z-формы атакуются границы между ней и В-формой.

Генные инженеры, встраивая все новые и новые участки ДНК из самых разных организмов в плазмиды, стали проверять их на чувствительность к однонитевой эндонуклеазе в надежде обнаружить кресты или Z-форму. Действительно, некоторые участки ДНК из высших оказывались очень чувствительными к ферменту. Они получили название гиперчувствительных мест. Когда удалось локализовать эти места, выяснилось, что они всегда находятся в важных регуляторных участках генома. Это привлекло к ним еще большее внимание. Когда же были определены их последовательности, то, к большому смущению исследователей, оказалось, что они – не перевертыши и не чередующиеся пурин-пиримидиновые участки. Как правило, гиперчувствительными к однонитевой эндонуклеазе оказывались последовательности, которые в одной цепи содержат только пурины, а в другой – только пиримидины, т. е. гомопурин-гомопиримидиновые последовательности типа (Г)n•(Ц)n или (ГА)n•(ТЦ)n.

Как же это следовало понимать? Может быть, однонитевая эндонуклеаза предпочтительно атакует такие последовательности, даже если они находятся в нормальной В-форме? Или эти последовательности способны принимать в сверхспиральной ДНК какую-то новую, до сих пор не обнаруженную форму ДНК?

Последняя возможность была особенно интересной, поскольку это означало бы, что мы еще не знаем о структуре ДНК что-то очень важное, причем это «что-то» могло оказаться существенным для функционирования ДНК в клетках эукариот. Специалисты по структуре ДНК взялись за работу, пытаясь выяснить образуют ли гомопурин-гомопиримидиновые последовательности альтернативную структуру, а если образуют, то какую именно.

Возможно, рассуждали одни, эти последовательности могут образовывать левую спираль, не Z-форму, а какую-то другую левоспиральную форму, одну из тех, что можно построить с помощью молекулярных моделей. Нет, возражали другие, все дело в том, что это очень однородные последовательности и поэтому две комплементарные нити могут проскальзывать друг относительно друга, образуя две однонитевых петли по краям гомопурин-гомопиримидинового участка. Однонитевая эндонуклеаза атакует эти петли, что и делает такие последовательности гиперчувствительными. А может быть, указывали третьи, такие последовательности образуют четверные спирали, еще одну гипотетическую структуру, предложенную теоретиками на основе «игры» с молекулярными моделями. Однонитевая эндонуклеаза атакует вершину такой структуры, где должны быть однонитевые петли.

Очень скоро стало ясно, что сам по себе факт гиперчувствительности к однонитевой эндонуклеазе мало что дает, тем более что оставался открытым вопрос об избирательном действии самого фермента. В начале 1985 года В. Лямичев, С. Миркин и автор этих строк (мы тогда работали в Москве, в Институте молекулярной генетики[3]) решили применить к исследованию этого запутанного вопроса метод двумерного гель-электрофореза.

Была сконструирована плазмида, несущая последовательность (ГА)₁₆ •(ТЦ)₁₆. Топоизомеры этой плазмиды были подвергнуты разделению методом двумерного электрофореза. На картинах электрофореза наблюдались характерные разрывы, как в случае крестов и Z-формы. Эти разрывы отсутствовали в контрольных экспериментах с плазмидой, в которую не был встроен участок (ГА)₁₆ •(ТЦ)₁₆. Пятна, отвечающие следующим за разрывом топоизомерам, исчезли из картин двумерного фореза после обработки плазмиды со вставкой однонитевой эндонуклеазой. Эти опыты показали, что под действием отрицательной сверхспирализации в гомопурин-гомопиримидиновой последовательности на самом деле образуется некая альтернативная структура. Но, может быть, образуется одна из уже известных альтернативных структур, крест или Z-форма, просто требования к последовательности на самом деле не столь строги, как принято считать?