Самая главная молекула

Химики, биохимики и биофизики взялись за поиск адекватного инструмента, в частности, автор этих строк приложил большие усилия в этом направлении. Первой идеей было использовать способность ДНК образовывать тройную спираль, о чем мы уже говорили в главе 9. Идея казалась очень привлекательной. Достаточно выбрать целевую последовательность в геноме из, скажем, 16 нуклеотидов и синтезировать соответствующую цепь однонитевой ДНК из 16 нуклеотидов, которая образовывала бы с выбранным участком геномной ДНК тройную спираль. На один из концов синтетической ДНК можно приладить активную химическую группу или даже целый белок-эндонуклеазу, способный разрезать ДНК там, куда он доставлен. Но проблема с триплексами в том, что они образуются только в тех местах генома, в которых в одной цепи стоят одни пурины (А и Г), а, соответственно, в комплементарной цепи одни пиримидины (Т и Ц). Такие участки длиной в 16 или более нуклеотидов редко встречаются в геноме, что резко сужает выбор целевых участков для разрезания. Так что от ДНКовых триплексов пришлось отказаться.

Следующей идеей было использовать синтетический аналог ДНК, ПНК, или пептидную нуклеиновую кислоту. Этот очень интересный синтетический аналог ДНК был изобретен в 1991 году в группе Питера Нильсена в университете Копенгагена. ПНК имеет те же основания, что и ДНК, но вместо сахарофосфатного остова основания присоединены к пептидному остову, похожему на остов белковой цепи (рис. 45). Поскольку, в отличие от ДНК, ПНК не несет отрицательного заряда, две молекулы ПНК образуют с одиночной цепью ДНК очень прочные триплексы. Эти триплексы настолько прочные, что две молекулы ПНК в определенных условиях способны раскрыть двойную спираль, образовав триплекс с одной из цепей, оставив комплементарную цепь без партнера (рис. 45). У ПНК множество применений, но нас сейчас интересует одно из них, состоящее в превращении обычных рестриктаз, узнающих последовательности из шести нуклеотидов, в инструмент с гораздо большей избирательностью. Как это делается, схематически показано на рис. 45.

Рис. 45. ПНК имеет те же основания, что и ДНК (обозначены как В), но они прикреплены к совсем другому остову, чем в ДНК, напоминающему остов молекулы белка. Так называемая бис-ПНК, состоящая из двух коротких молекул ПНК, связанных гибкой молекулярной связкой, образует триплекс с одной из цепей ДНК (посредством триад, изображенных на рис. 42), оставляя комплементарную цепь в виде однонитевой петли. В нижней части рисунка дана схема того, как бис-ПНК используется для того, чтобы превратить обычную рестриктазу в очень редко расщепляющий ДНК инструмент

Целевой участок в геноме для связывания двух молекул ПНК с образованием триплекса выбирается таким образом, чтобы он чуть-чуть перекрывался с участком связывания какой-нибудь рестриктазы. После связывания ПНК с ДНК препарат обрабатывается соответствующей рестриктазе метилазой. Метилаза метилирует все участки узнавания в геноме, кроме одного, который стал недоступен для связывания метилазы, так как его дуплексная структура была нарушена связыванием ПНК. Затем делается так, чтобы связывание ПНК с ДНК было разрушено. В результате единственное место связывания рестриктазы с ДНК восстанавливается, тогда как все остальные места связывания не работают, поскольку они прометилированы. Теперь рестриктаза разрежет ДНК только в одном месте, в том, которое было изначально выбрано для этой цели. Конечно, мы несколько утрировали ситуацию, неметилированных участков в геноме может оказаться несколько, но ясно, что такой подход должен резко увеличивать избирательность нуклеаз, что и было экспериментально продемонстрировано в моей лаборатории в Бостонском университете в работе, выполненной совместно с Нильсеном.

Все же подход, основанный на ПНК, оказался слишком сложным, и, что самое главное, его не удавалось использовать в живой клетке. А именно редактирование ДНК непосредственно в живой клетке представляет наибольший интерес. К началу 2010 года два очень изощренных биохимические метода специфического разрезания ДНК были разработаны в биотехнологических компаниях. И их уже стали применять для редактирования геномов. Но в начале 2013 года произошел подлинный прорыв, который самым радикальным образом изменил ситуацию. Появился метод, носящий неуклюжее название КРИСПР-кас.

Метод целиком базируется на системе приобретенного иммунитета у бактерий, о котором рассказано в главе 6.