Старец Макарий скончался в конце 1860 года, препоручив отца Исаакия на попечение своему ученику и преемнику старцу Амвросию. Отец Исаакий, послушный воле своего умершего духовного наставника, с готовностью вручил себя духовному руководству старца Амвросия. И хотя старец Амвросий был на два года моложе отца Исаакия, он относился к своему новому духовному наставнику с неизменной преданностью, сыновней любовью и послушанием. Уже занимая высокие посты в монастырской иерархии, он каждую субботу, накануне служения, отправлялся в скит для исповеди. На исповедь к старцу Амвросию приходило много народа, и отец Исаакий стоял со всеми в очереди, терпеливо дожидаясь, когда придет его черед. Ждать иногда приходилось очень подолгу. Послушание отца Исаакия было образцовым. Будучи даже настоятелем обители, он никогда не принимал важных решений и не приступал ни к каким делам без совета и благословения своего старца. И следовал этому неукоснительно. Будучи уже в преклонном возрасте игуменом обители, а позже, в 1885 году, архимандритом, ходил он на исповеди к своему духовнику и беседовал с ним, стоя на коленях, как простой послушник. И не только сам регулярно исповедовался у старца, но и призывал к этому монастырскую братию: «Отцы и братья! Нужно ходить к старцу для очищения совести», – повторял он при каждом удобном случае.
Через два года после смерти старца Макария, в 1862 году, скончался и старец Моисей. Помня суровый наказ старца Макария, отцу Исаакию пришлось заменить старца Моисея в управлении обителью. 8 сентября 1864 года отец Исаакий был возведен архиепископом Гермогеном в сан игумена.
Игумен Исаакий впоследствии с горькой иронией говорил: «Я принял обитель с одним гривенником». Так оно было на самом деле: монастырская казна состояла действительно из гривенника, да и то случайно завалившегося в трещину денежного ящика старца Моисея. Однако это не значит, что монастырь вовсе не имел доходов, просто не было свободных денег: Оптина активно строилась и развивалась, львиная доля поступлений в монастырскую казну уходила на пополнение библиотеки и издательскую деятельность.
Новый игумен продолжил дело старца Моисея и прежде всего достроил храм во имя Всех Святых на новом кладбище. В историю Оптиной пустыни игумен Исаакий вошел как великий строитель и устроитель обители. При нем было завершено строительство водопровода, Казанский собор был значительно расширен, и в нем устроен новый иконостас. Обновили иконостас и в Введенском соборе.
В 1874 году, по завещанию умершего в 1873 году скитоначальника старца Илариона, на пожертвованные деньги за стенами монастыря было выстроено большое здание для больницы с церковью во имя Святого Илариона Великого. При этой больнице была обустроена аптека, снабженная необходимыми медицинскими средствами для общего бесплатного пользования братии и посетителей обители. Аптека находилась под наблюдением врачей из числа братии.
В память старца Макария в скиту был устроен придел во имя преподобного Макария Египетского и приобретен колокол в семьсот пятьдесят пудов весом. Были воздвигнуты здания хлебной, настоятельской кухни, братской, прачечной, переделаны братский корпус, настоятельские покои, скотный двор. Игумен Исаакий поощрял и поддерживал усердие отца-казначея Флавиана в разведении в обители садов и огородов.
Вся эта бурная деятельность требовала огромных материальных затрат. В первое время отсутствие свободных средств тяжелым бременем легло на плечи нового настоятеля. Бывали такие времена, что не на что было содержать братию, кладовые пустели. Однако все как-то благополучно разрешалось: то богатый помещик совершит благотворительный дар и уплатит все долги монастыря, то щедрый жертвователь завещает обители пятнадцать тысяч рублей.
Конечно, настоятель и сам не плошал. Пригодились в управлении огромным монастырским хозяйством навыки, приобретенные отцом Исаакием во времена его мирской жизни, когда он успешно вел дела купеческого дома Антимоновых. Купеческая сметка помогала ему искать дополнительные доходы для обители. Он догадался устроить в монастыре собственный свечной завод, начавший действовать и приносить доход с 1865 года. Заметив возросший спрос паломников на духовную литературу, благословил строительство нового большого корпуса для книжной лавки. С выгодой для обители были куплены лесные участки, что раз и навсегда решило проблемы с топливом и строевым лесом. По случаю были приобретены и луговые земли на Болховской мельнице. Оптина пустынь стала одним из самых процветающих монастырей России второй половины XIX века.
Но за заботами о материальном благе обители не забывал настоятель и о благотворительности. Простому народу, приходившему в обитель во множестве, бесплатно раздавались крестики, священные изображения, книжки нравственного содержания.